CCF20130428020

Otrzymywanie limfocytów z narządów iimfatycznych

•    zwierzą doświadczalne (myszki) przed wyizolowaniem należy badanych narządów należy skrwawić

•    całość przeprowadzamy w temperaturze 4’C na łaźni lodowej

•    umieszczone w płynie odżywczym izolowane narządy wyczesujemy igłą preparacyjną

•    zawiesiną komórek przecedzamy przez sito do probówek i wirujemy 15-30 min zbieramy supernatant, wirujemy i płuczemy 3x przy 1200 obr/min

•    po ostatnim wirowaniu osad z komórek zawieszamy w 1-2 ml płynu odżywczego Otrzymywanie makrofagów

•    wypłukujemy jamę otrzewnową za pomocą płynu odżywaczego (Hanksa)

•    liczbę makrofagów można zwiększyć wywołując zapalenie poprzez dodanie dootrzewnowo jałowego oleju parafin lub bulionu

IZOLACJA KOMÓREK Z KRWI OBWODOWEJ

1.    Otrzymywanie limfocytów z krwi obwodowej metodą hemolizy.

•    mieszamy równe ilości krwi i wody destylowanej jałowej w probówce wirnikowej

•    pozostawiamy na 20-30s

•    dodajemy płyn Hanksa w proporcji 1:10

•    wirujemy 10 min przy obrotach 1650/min

•    osad leukocytów 3x płuczemy płynem Parkera za każdym razem wirując

2.    Otrzymywanie leukocytów z krwi obwodowej metodą sedymentacji

Sedymentacja spontaniczna:

•    pobraną krew na heparynę pozostawiamy w termostacie przez Ih w temperaturze 37"C

•    zbieramy kożuch leukocytów, wirujemy przez 10 minut w 1650obr/min

•    w celu pozbycia się resztek erytrocytów (przez hemolizę) dodajemy 0,5ml jałowej wody destylowanej

•    osad leukocytów płuczemy 3x płynem Parkera za każdym razem wirując Sedymentacja w żelatynie

•    pobraną krew na heparynę mieszamy w równych    proporcjach    z    1-3% żelatyną i pozostawiamy w temp. 37"C

•    zbieramy osad leukocytów, wirujemy przez    10 minut przy obrotach 1050/min

•    osad 3x płuczemy płynem Parkera za każdym razem wirując Sedymentacja w alkoholu poliwinylowym

•    pobraną krew na heparynę mieszamy w równych proporcjach z 1-2% roztworem alkoholu winylowego (po lOml) i pozostawiamy na 45 minut w temperaturze pokojowej

•    po wyznaczonym czasie tworzą się 2 warstwy: górna leukocyty, dolna erytrocyty

•    górną warstwę zbieramy i wirujemy przez 30 minut przy obrotach 1600/min

•    w celu pozbycia się resztek erytrocytów (przez hemolizę) dodajemy 0,5ml jałowej wody destylowanej

•    wirujemy i płuczemy 3x przy obrotach 1600/min

•    po ostatnim wirowaniu osad komórek zawieszamy w l-2ml płynu Eagle'a

3.    izolacja komórek z krwi obwodowej metoda gradientu gęstości

Wykorzystuje się różnice w wielkości i ciężarze właściwym izolowanych komórek. Gradient posiada specjalnie dobraną gęstość względną i określona warstwa tworzy sito zatrzymujące na powierzchni izolowaną populację komórek lżejszych, przepuszczając komórki cięższe.

1.    Nie rozcieńczoną krew pobraną na heparynę nawarstwiamy na gradizol G (1,5/2,5 krwi)

•    wirujemy przez 25 minut przy obrotach 1650obr/min

•    otrzymujemy frakcje leukocytów, granulocytów oraz krwinki czerwone jako osad

2.    Krew mieszamy w równych objętościach z płynem odżywczym

•    na 3ml gradizolu L nawarstwiamy 4 ml krwi rozcieńczonej

•    wirujemy przy 1600obr/min

•    otrzymujemy od dna: krwinki czerwone, gradizol L, leukocyty, osocze

3.    Pobraną krew na heparynę w ilości 2ml nawarstwiamy na 2ml ficolu w probówce wirnikowej

•    wirujemy 40min przy 1600obr/min

•    frakcje od dna: erytrocyty i granukocyty, ficol, leukocyty, plazma

24. Testy stosowane do badań parametrów nieswoistej odporności komórkowej

•    test NBT

•    indeks fagocytarny

•    RBA, PKA

Test NBT (Nitro Blue Tetrazolium) - test zdolności zabijania wewnątrzkomórkowego zarazków. Spontanicznej redukcji soli tetrazoliowych (NBT) do nierozpuszczalnego w wodzie formazanu przez neutrofile i monocyty krwi obwodowej.

Metoda Spektrofotometryczna

® Mieszamy w równych objętościach (po 0,3ml) pełnej heparynizowanej krwi i 0,1% NBT i inkubujemy w 37"C (lub 22) w łaźni wodnej przez 15min

21