DSC14

96 Rozdział 7

Mutacje Mowę u £ coli

W początkowym okresie badań nad bakteriami wiciu bakteriologów sądziło,

2e to czymuki środowiska indukują powstawanie zmian w komórce bakteryjnej, umożliwiając jej przetrwanie i przystosowanie się do nowych warunków.

Losowy charakter mutacji potwierdzają dwa testy;

a)    test fluktuacyjny Lurii i Delbrtlcka,

b)    test Lederbcrgów - metoda replik (odcisków).

a) Luria i Delbruck przeprowadzili w 1943 roku doświadczenie, które dostarczyło niezbitych dowodów na to, że bakterie, podobnie jak organizmy eukariotyczne, są zdolne do mutacji spontanicznych. Zastosowali oni szczep E. coli wrażliwy na bakteriofaga Tl (Ton⁵). W obecności faga większość bakterii ginie, rosną tylko te komórki które uzyskały oporność (Ton^R) w wyniku mutacji (S i R są symbolami fenotypowej wrażliwości i oporności na faga, nie są natomiast oznaczeniami kodujących te cechy genów).Wcześniejsi badacze przypisywali taki efekt adaptacji, 7akładall że bakteria przystosowuje się do obecności faga. Doświadczalnie można jednak sprawdzić, czy oporność w populacji bakterii pojawia się bez względu na obecność bakteriofaga.

Jeśli kulturę bakterii początkowo stanowi mała liczba komórek (np. 100) i mutacje będą powstawały spontanicznie podczas wzrostu, wtedy w populacji rośnie liczba komórek opornych na infekcję fagiem. Liczba komórek opornych zależeć będzie od fazy wzrostu, w której powstała mutacja. Jeśli mutacja powstanie we wczesnej fazie wzrostu, to wiele komórek potomnych uzyska oporność. Jeśli mutacja zajdzie w późniejszej fazie wzrostu, to nieliczne komórki zyskają tę cechę i ostatecznie mała liczba kolonii będzie niewrażliwa na obecność faga. Gdyby jednak każda komórka bakteryjna miała te same zdolności uzyskania oporności w wyniku fizjologicznego przystosowania się, to oddzielne populacje miałyby podobną liczbę komórek opornych na Tl. Wykorzystując taki sposób myślenia, Luria i Delbrfick wykonali następujące doświadczenie;

Pierwszy wariant

Kulturę bakterii Ton^s o małej gęstości (100 komórek) hodowano przez pewien czas do uzyskania próby o dużej gęstości (10 milionów komórek na mililitr). Wysiano próbę na 10 płytek z pożywką agarową zawierającą faga Tl i liczono ilość opornych kolonii.

Drugi wariant

Kulturę bakterii Ton^s o malej gęstości komórek zaraz po przygotowaniu rozdzielono na 10 prób, które po hodowli do dużej gęstości wysiano na płytki z fagiem i liczono ilość opornych kolonii.

Luria i DefbrOck zauważyli, że liczba mutantów opornych na 10 płytkach pochodzących z oddzielnych hodowli (wariant drugi) znacznie się różniła, natomiast

|S7    J?;

Mutacje

liczba kolonii opornych na 10 płytkach uzyskanych z wysiania tej samej hodowli była podobna.

Prostym wyjaśnieniem tak dużego zróżnicowania liczebności wśród oddzielnie rosnących populacji są przypadkowe zmiany genetyczne, które albo zachodzą w późnej fazie wzrostu (mała liczba mutantów) albo we wczesnej fazie wzrostu (duża liczba mutantów). Brak zróżnicowania częstości mutacji w wariancie pierwszym doświadczenia można wytłumaczyć tym, że mutacja powstała zanim rozdzielono próby i zanim bakterie zetknęły się z fagiem. Uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, że mutacje zachodzą losowo (spontanicznie) w genomie i nie są wynikiem przystosowania się do środowiska.

b) Test Ledcrbergów, podobnie jak poprzedni, jest prostym doświadczeniem polegającym na hodowli bakterii wrażliwych na antybiotyk czy bakteriofaga Tl na płytkach z nieselektywnym podłożem agarowym. Następnie za pomocą stempla (klocka obciągniętego sterylnym welurem) wykonuje się odcisk z płytki macierzystej i bakterie przenosi się na 2 lub więcej płytek z podłożem selektywnym (np. zawierającym antybiotyk lub faga Tl). Wyrosną tylko kolonie oporne na dany czynnik.

~ Jeśli mutacja jest wynikiem przystosowania do środow iska (powstała po kontakcie z selektywnym podłożem), to układ wyrosłych kolonii na zreplitowanych płytkach powinien być różny.

- Jeśli mutacja zaszła jeszcze przed kontaktem z selektywnym medium (spontanicznie), to układ wyrosłych kolonii na zreplikownych płytkach powinien być identyczny.

Wyniki, które uzyskali Lederbergowie w swoim doświadczeniu, potwierdziły hipotezę o losowym charakterze mutacji.

Mutacje adaptacyjne u £ coli

U £ coli przeprowadzono badanie, które mogłoby sugerować, że bakteria potrafi programować mutacje zgodne z presją selekcyjną. Szczep £ coli posiadający mutację nonsens w genie LacZ produkuje niefunkcjonalny enzym - uszkodzoną P-galaktozydazę. Komórki te nie mogą wykorzystywać laktozy jako źródła węgla, oznaczamy je lacr. Jeśli zajdzie mutacja, która zmieni kodon STOP w kodujący właściwy aminokwas, to funkcja enzymu zostanie przywrócona i komórki mogą rosnąć na podłożu z laktozą jako jedynym źródłem węgla.

Doświadczenie Caimsa i współpr. z 1988 roku polegało na wysianiu bakterii lac na pożywki z laktozą jako jedynym źródłem węgla. Liczba komórek, która pojawiła się na płytkach była znacznie większa niż w przypadku mutacji losowych. Komórki uzyskały genotyp i fenotyp tac ‘ w wyniku mutacji adaptacyjnych, powstałych pod wpływem środowiska.

Od 1988 roku przeprowadzono wiek doświadczeń, które wykazały ktmmm mutacji adaptacyjnych, jednak pogląd, że bakterie potrafią programować mutacje