DSC05

wali inne szczepy bakteryjne, w których poprzez rewersję mutacji można oceni*,

substancji chemicznych. Test na rewersję mutacji w systemie Eschcrichia coli lac's ^rr>u'*k»,

----    ..    --------- —--^ *^<>st*i, "

///

w ]990 roku. Jest on alternatywą dla testu Amesa Do oceny mutagenności został ^ szczepy E. coli łacZ-. Bakterie z allelem lacZ- kodują nieaktywną formę (ł-galoktozyd*xyvu⁷ id laktozy jako źródła węgla, bakterie te wymagają do wzrostu aktywnej formy tego erizvr^

l l l. . . . i____J_    i____j _l.L.___t_____ 1.__....    ^rnv

///

i

£

hydrolizuje laktozę do glukozy i galaktozy. Rewersja do formy lacZ+ pozwala na wzrost

^u. W

a podłożu zawierającym laktozę. Innym testem używanym w ocenie mutagenności substancji ^ test rewersji mutacji w systemie E. coli WP2. Procedura jest taka sama jak w teście Ames'a z tym*?

wzrost bakterii wymaga tryptofanu a nie histydyny, ponieważ £. coli WP2 nie potrafią rosnąć na podłożu nie zawierającym tryptofanu w wyniku mutacji w operonie tego aminokwasu.

Standardowy test Amesa oparty jest na wykorzystaniu zdolności do rewersji histydyno-zależnych auksotroficznych mutantów bakterii Salmonella typhimurium do form prototroficznych. które posiadają zdolność do wzrostu na podłożu minimalnym, pozbawionym czynnika wzrostowego (w tym przypadku aminokwasu L-histydyny). Skonstruowano wiele szczepów testowych zawierający różne mutacje w operonie biosyntezy histydyny (9 genów - 9 enzymów). Działanie czynnika mutagennego na komórki takiego szczepu może powodować rewersję mutacji dającą w efekcie przywr tnie funkcjonalnego genu i w konsekwencji, zdolności komórek do wzrostu na podłożu nie zawierającym histydyny.

Szczepy Salmonella typhimurium stosowane w teście Amesa:

TA 1535 - mutant z substytucją, która powoduje mutację mylną w genie kodującym pierwszy enzym w szlaku syntezy histydyny. Zmutowany enzym ma prolinę podstawioną w miejscu leucyny w normalnym białku;

TA 100 - ma podobny defekt do szczepu TA 1535, ale wykrywa szerszy zakres mutagenow,

TA 1537 - ma mutację typu przesunięcia ramki odczytu (delecja 1 nukleotydu) w innym genie niż TA 1535;

TA 1538 - ma mutację typu przesunięcia ramki odczytu (insercja 1 nukleotydu) w tym samym genie co szczep TA 1537;

TA 98 - jest podobny do szczepu TA 1538, ale wykrywa szerszy zakres mutagenów;

TA 102 i TA 104 w miejscu zapisu rewersji zawierają mutacje ochrę (kodon „stop”).

Oprócz opisanych mutacji każdy z tych szczepów ma jeszcze dodatkowe mutacje takie jak;

1. Mutanty nie mają systemów naprawy⁷ uszkodzeń typu „reperacji przez wycinanie nukleotydów” --— NER, które w dzikich szczepach są odpowiedzialne za naprawę uszkodzeń DNA powstałych pod wpływem mutagenów⁷. W efekcie, uszkodzenia DNA powstałe pod wpływem kontaktu 7 badanym w teście .Ames a mutagenem nie są naprawiane i wszystkie mutacje punktowe są widoczne fenotypowo.

2. Mutant}’ posiadają defekty⁷ w^t budowie lipopolisacharydu (LPS) co pozwala na łatwiejszą penetrację związków chemicznych do wnętrza komórki w porównaniu z dzikim szczepem.

Podłoże minimalne używane do testu zawiera śladowe ilości histydyny⁷ dodawane tylko do tzw. to-p-agaru, tworzącego wierzchnią warstwę agaru. Te śladowe ilości histydyny⁷ są konieczne, ponieważ niektóre mutageny działają tylko na replikujące DNA. Kiedy mutanty Amesa są wysiewane na takie podłoże, rosną tylko dotąd dokąd nie wyczerpią histydyny (2-3 podziały⁷ komórkowe trwające ok. wł godziny) i tworzą ledwie widoczne zmętnienie w miękkim agarze. W przeciwieństwie do nich rewertanty tworzą duże kolonie, ponieważ ich wzrost nie jest limitowany ilością histydyny w podłożu.

Wiele związków chemicznych występujących w⁷ przyrodzie nie jest mutagenna dopóki nie zostanie skonsumowana przez zwierzę (lub człowieka). Jedną z przyczyn jest fakt, że w wątrobie w procesie detoksykacji niektórych związków⁷ chemicznych powstają związki, które są bardzo silnymi mutagenami. Z tego powodu wiele związków⁷ badanych w teście Ames a powinno być rutynowo inkubowanyćh z wyciągiem z wątrób)⁷ szczura (frakcja S9) w środowisku tlenowym, aby oksygenazy wątroby „aktywowały” badany związek. Dopiero zaktywowany związek powinien być stosowany do testu na bakteriach.