img074 8

jonitach obok adsorpcji wymiennej może /mliod/.U adsorpcja powierzchniowa, zaś absorbenty mogą przejawiać właściwości wymienne lub rozdzielcze).

Ko/d/iał składników w chromatografii ndsorpcyjncj uwarunkowany jest głównie różnicami w położeniu i charakterze polarnych podstawników w cząsteczkach adsorbatu; w chromatografii jonowymiennej różnicami w ładunku elektrycznym jonów, a w chromatografii podziałowej odmienną rozpuszczalnością solutu w obu fazach ciekłych.

W chromatografii powinowactwa fazę stacjonarną stanowi obojętny chemicznie polimer (np. Sepharose) związany z aktywnymi substancjami biologicznymi, takimi jak przeciwciała, substraty lub inhibitory enzymów oraz receptory hormonów. Podczas rozdziału chromatograficznego, z tymi substancjami fazy stacjonarnej wiążą się tylko te składniki analizowanej mieszaniny, które wykazują do nich swoiste powinowactwo, tj. odpowiednie antygeny, enzymy lub hormony. Składniki swoiście związane przez nośnik mogą być wymyte z żelu przez zwiększenie siły jonowej, zmianę pH lub wprowadzenie do fazy ruchomej czynnika rozrywająceg powstałe połączenia.

Ze względu na technikę rozdziału wyróżnia się trzy rodzaje chromatografii: kolumnową, bibułową oraz w żelach.

4.1.3. Metody stosowane w chromatografii

Każdy proces chromatograficzny można przeprowadzić za pomocą trzech zasadniczych metod, które różnicują się najwyraźniej na przykładzie adsorpcyjnej chromatografii kolumnowej.

Metoda analizy czołowej. Roztwór badanej mieszaniny składników przesącza się w sposób ciągły prze/ kolumnę, przemytą uprzednio czystym rozpuszczalnikiem, aż do całkowitego nasycenia powierzchni adsorbentu. Podczas przepływu tego roztworu przez kolumnę adsorbentu następuje zróżnicowanie prędkości wędrowania poszczególnych składników, wynikające z różnicy w ich zdolnościach adsor- ; bowania się. Składnik wykazujący najmniejsze powinowactwo do fazy nieruchomej ma największą prędkość wędrowania, stanowi pasmo pierwsze od dołu kolumny i jedyne, które może być uzyskane w stanic czystym; wszystkie pasma ponad nim reprezentują mieszaninę dwóch i więcej składników. Analiza czołowa umożliwia jedynie określenie, ile składników zawiera badana mieszanina i pozwala otrzymać w stanic czystym tylko składnik najsłabiej adsorbowany.

Motodo wypierania (rugowania). Na wierzchołku kolumny chromatograficznej umieszcza się badaną mieszaninę w małej objętości roztworu, a następnie rozsuwa się od siebie pasma poszczególnych substancji pr/e/ przemywanie kolumny roztworem zawierającym kilka składników o różnych właściwościach wypierających, tj. wykazujących silniejsze zdolności adsorpcyjnc niż substancje rozdzielane. Metoda wypierania nadaje się tylko do rozdzielania substancji wykazujących odwracalną adsorpcję; w praktyce umożliwia ona jedynie półilościowe określenie zawartości poszczególnych składników w badanej mieszaninie.

Metoda wymywania (elucyjna). Metoda ta ma podstawowe znaczenie praktyczne, gdyż umożliwia rozdzielanie oraz ilościowe odzyskanie poszczególnych składników dość złożonych mieszanin. Przeprowadza się ją w dwóch etapach. Najpierw nicwicl-kii objętość roztworu badanej mieszaniny wprowadza si\ nu wierzchołek kolumny (adsorpcja), a następnie rozwija się chromatogram przez przemywanie kolumny rozpuszczalnikiem czystym lub z niewielkim dodatkiem substancji powierzchniowo i /ynncj albo serią rozpuszczalników o coraz większej mocy clucyjnej (desorpcja). Substancja o większej zdolności adsorbowania się (trudna desorpcja i łatwa ponowił. i adsorpcja) przesuwa się wzdłuż kolumny wolniej niż substancja słabiej adsor-bowuna (łatwa desorpcja i zwolniona ponowna adsorpcja). Rozdział składników «» dużych różnicach szybkości wędrowania osiąga się na kolumnie krótszej. Do U.ulników o małych różnicach w prędkości migracji trzeba stosować dłuższą kolumnę i większą ilość cieczy wymywającej. W oddzielnych odbieralnikach zbiera itę kolejno frakcje przesączu, z których każda zawiera jeden składnik badanej mieszaniny. Metoda elucyjna jest podstawowym sposobem przeprowadzania właściwie każdej chromatografii. Pewnego rodzaju jej modyfikację stanowi wymywanie w gradiencie stężeń, tj. układem rozpuszczalników o stopniowo zmieniającym się nk ladzie i wzrastającej sile wymywania.

4 1.4. Śledzenie przebiegu procesu chromatograficznego

Mozdział chromatograficzny substancji barwnych śledzi się bezpośredenio na bezbarwnym adsorbencie. Chromatografia substancji bezbarwnych wymaga zastosowania metod, które mają na celu uwidocznienie obecności rozdzielanych substancji w różnych miejscach adsorbentu czy stadiach procesu lub też wykrywanie ich w wycieku. Rozróżnia się stały i ciekły chromatogram substancji bezbarwnych.

Chromatogram stały bada się najczęściej po przeprowadzeniu rozdzielanych bezbarwnych substancji w związki barwne, np. po spryskaniu kolumny lub powleczeniu jej odczynnikiem dającym barwne połączenia, a np. substancje fluoryzujące uwidacznia się za pomocą lampy kwarcowej.

( hromatogram ciekły analizuje się rejestrując stężenie substancji w wycieku metodami pozwalającymi śledzić poszczególną właściwość fizykochemiczną wycieku Należy tu wymienić: pomiar zmian absorpcji światła, interferometryczny pomiar /mian współczynnika załamania światła, rejestrację zmian potencjału elektrycznego, przewodnictwa czy stałej dielektrycznej, natężenia prądu płynącego przez badany roztwór, zmian pH, pomiar radioaktywności eluatów itp.

Chromatografia kolumnowa. W najprostszym ujęciu kolumny chromatograficzne są to miki szklane o długości i średnicy określonej dla danego nośnika i badanej Ktihstancji, wyciągnięte z jednego końca i zaopatrzone powyżej tego końca w do-./lifowany korek szklany oraz porowatą płytkę szklaną luźno umieszczoną lub wtopioną ponad korkiem. Właściwą kolumną jest złoże nośnika, na którym zachodzi proces chromatograficzny. Można je przykryć od góry dobrze dopasowanym kiążkiem bibuły filtracyjnej, co ułatwia wprowadzenie roztworu badanego i rozpuszczalnika bez deformowania górnej warstwy złoża. Niektórzy zalecają położenie krążka bibuły filtracyjnej na porowatą płytkę szklaną, tj. pod złoże nośnika, aby

95