img089 2

4.4.4. Przykłady jakościowej oraz iloścłowo| analizy aminokwasów metodą chromatografii podziałowej bibułowoj

Rodzaje hydrolizy białek. Znane są trzy sposoby hydrolizy białek: kwasowa, zasado wa i enzymatyczna.

Do hydrolizy kwasowej używa się roztworów MCI i H₂S0₄ oraz mieszaniny HCI/HCOOH (88 90%) w stosunku 1:1. Na ogół stężenie kwasu jest odwrotnie proporcjonalne do temperatury reakcji. Najmniejszą destrukcję w czasie hydrolizy (z zastosowaniem środków ostrożności) powodują roztwory HC1 i HCOOH. Brązo-woczame produkty rozkładu, zwane huminami, są związane z kompletnym roz kładem tryptofanu, pewną degradacją aminokwasów hydroksylowych (Ser, Thr) i Cys oraz z obecnością cukrowców.

Do hydrolizy zasadowej białek używa się mocnych zasad, jak: NaOH. KOH. Ba(OH)₂, powodują raccmizację oraz całkowitą lub częściową destrukcję większości aminokwasów, w szczególności ar< gminy, cysteiny, treoniny. Hydroliza alkaliczna jest jednak niezbędna do oznaczania tryptofanu (pat

ćw. 9.7).

W hydrolizie enzymatycznej białek stosuje się różne enzymy proteolityczne (np. pepsynę, trypsynę,] chymotrypsynę) w celu uniknięcia destrukcji i racemizacji aminokwasów. Ma to jednak pewne cechy ujemne: 1) bardzo rzadko hydroliza jest kompletna: 2) enzymatyczne trawienie białek trwa co najmn: kilka dni; 3) enzymy są białkami i ulegają w toku hydrolizy częściowo autolizic, uwalniając włas aminokwasy do badanego hydrolizatu.

Standardowa hydroliza kwasowa. Dokładną odważkę (2-6 mg) sproszkowanego biał ka wprowadza się do małej probówki z trudno topliwego szkła, zadaje 2 ml 5,5 M roztworu HCI (nadmiar HC1 zmniejsza straty podczas hydrolizy). Zatopioną probówkę trzyma się w cieplarce w temp. 110°C przez 24 godz. Do hydrolizy używa się 5,5 M roztworu HCI o stałym punkcie wrzenia, który przyrządza się następująco: mieszaninę 510 ml stężonego roztworu HCI cz.d.a. z 420 ml wody destyluje się / szybkością 8-10 ml/min. Pierwsze 650 ml mieszaniny destyluje się w temp. I08°C, a następne 200 ml w temp. 110°C. Tę porcję używa się do hydrolizy białka (ok. 5,5 M HCI).

Usunięcie HCI z hydrolizatu. Po 24 godzinach hydrolizy probówkę po oziębieniu otwiera się i jej zawartość przenosi ilościowo do małej szklanej parowniczki, którą umieszcza się w eksykatorze próżniowym nad stałym P₂O_s (wiązanie H₂0) i KOH (wiązanie par HCI). Po odparowaniu do sucha zawartość parowniczki rozpuszcza się w kilku ml H₂0 i ponownie odparowuje do sucha w podanych warunkach. Czynność tę powtarza się wielokrotnie aż do całkowitego usunięcia HCI. Można również używać w tym celu płuczki Drcchscla.

Ćwiczenie 4.5. Jakościowa krążkowa chromatografia bibułowa aminokwasów

Odczynniki:

1)    CHjCOOH lodowaty.

2)    n-butanol.

3)    0.0! M roztwór alaniny, argininy i lcucyny w 0.1 M HCI oraz. roztwór badany zawierający po 0,01 mol wymienionych aminokwasów w I litrze.

4)    0,5% roztwór ninhydryny w acetonie.

r

W ykonanie: Z bibuły Whatman nr I wyciąć krążek o średnicy o I cm większej niż przygotowane szalki Petriego. Pole krążka podzielić ołówkiem na 4 ćwiartki, w centrum których, na obwodzie zakreślonym w odległości 2 cm od środka krążka, nakroplić po 10 pl 0,01 M roztworów następujących aminokwasów: Arg, Ala i Leu (w poszczególnych trzech ćwiartkach) oraz 10 pi mieszaniny trzech wymienionych aminokwasów w ćwiartce czwartej. W środku krążka wyciąć otwór o średnicy ok. 2 mm. Pasek bibuły o szerokości ok. 1,5 cm zwinąć w zbity łącznik i umieścić pomiędzy centrum krążka a dnem szalki Petriego.

Na dno mniejszej szalki Petriego wlać fazę butanolową dwufazowego rozpuszczalnika (n-butanol/CH₃COOH/H₂0 = 4:1:5; por. ćw. 4.7), a na dno większej szalki Petriego fazę wodną. Krążek bibuły umieścić między dwiema szalkami tak, ażeby brzegi krążka wystawały poza szalki, a zwinięty pasek bibuły, umieszczony centralnie w formie knota, doprowadzał rozpuszczalnik na krążek. Po kilkudziesięciu minutach, gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do obwodu, wyjąć chromatogram i zaznaczyć linię czoła zwykłym ołówkiem. Wysuszyć w temperaturze pokojowej. Wywołać chromatogram zanurzając w 0,5% roztworze ninhydryny w acetonie i susząc w temperaturze pokojowej (10 min), a następnie w temp. 60°C (5 min). Plamy aminokwasów, pojawiające się w formie części współśrodkowych obwodów, należy obrysować ołówkiem. Zmierzyć drogę od startu do czoła rozpuszczalnika i od startu do linii plamy. Obliczyć R_f dla każdego aminokwasu. Zidentyfikować aminokwasy w mieszaninie.

Czas rozwijania chromatogramu zależy od średnicy knota i krążka: rozwija się tym szybciej, im szerszy jest knot i im mniejsza średnica krążka. Aminokwasy rozdzielają się dokładniej na dłuższej drodze ich wędrówki.

Ćwiczenie 4.6. Jakościowy rozdział mieszaniny kilku aminokwasów¹ w drodze spływowej chromatografii bibułowej jednowymiarowej

()dc/.ynniki:

1)    HCOOH (88 90%).

2)    H-butanol.

3)    0.005 M roztwór alaniny, cysteiny, argininy. kwasu glutaminowego i lcucyny w 0.1 M HCI oraz roztwór badany z mieszaniną kilku z wymienionych aminokwasów.

4)    0,5% roztwór ninhydryny w acetonie.

Wykonanie:

I. Przygotowanie chromatogramu. Na arkuszu bibuły Whatman nr 1 o szerokości 22,5 cm narysować 2 linie równoległe do krótszego brzegu, w odległości 5 i 9 cm od niego. Na linii startu oddalonej o 9 cm od brzegu zaznaczyć punkty nakroplenia roztworów aminokwasów w odległości 3,5 cm od siebie i 2,5 cm od dłuższych brzegów bibuły. Nanosi się po 10 pl roztworu następujących aminokwasów: Cys, Arg, Glu, Ala, Leu oraz roztwór badany.

Chromatogram rozwijać w komorach szklanych prostokątnych przez ok. 18 godz. w jednofazowym rozpuszczalniku n-butanol/HCOOH/H₂0 (75:15:10), który należy przygotować przynajmniej 3-4 godz. przed rozpoczęciem chromatografii i przechowywać w- pokoju chromatograficznym.

123