45302 IMG97

7AS. JAKOŚCIOWA ANALIZA CUKRÓW METODAMI CHROMATOGRAFICZNYMI

Metody chromatografii bibułowej Układy rozwijające:

1)    octan etylowy —kwas octowy —woda (3:1:3)

(glukoza, galaktoza, mannoza, arabinoza, ksyloza);

2)    octan etylowy—kwas octowy —woda (9:2:2)

(kwasy cukrowe);

3)    octan etylowy — pirydyna — woda (2:1:2)

(glukoza, galaktoza, mannoza, arabinoza, ksyloza);

4)    n-butanol—kwas masłowy — woda (1:1:1)

(cukrowce redukujące i nieredukujące);

5)    n-butanol —pirydyna —woda (45:25:40)

(pentozy, heksozy, dwucukry redukujące, glukozami na);

6)    chromatografia dwukierunkowa

a)    fenol—woda (1:1),

b)    butanol—kwas octowy —woda (4:1:5).

Układy wywołujące:

1)    Amoniakalny roztwór azotanu srebra (1 część 2°/₀ roztworu azotanu srebra +1 część 8% amoniaku). Chromatogram spryskać wywoływaczem, a następnie wysuszyć w suszarce o temperaturze 105° C w ciągu 5-10 min. Cukry redukujące wystąpią w postaci brunatnych plam;

2)    Etanolowy roztwór naftolu (1% etanolowy roztwór a-naftolu z dodatkiem 10°/o kwasu o-fosforowego). Po spryskaniu i wysuszeniu w temperaturze pokojowej ketozy ujawnią się w postaci barwnych plam;

3)    Butanolowy roztwór aniliny (1 część 17% butanolowego roztworu aniliny +2 część 6% butanolowego roztworu kwasu o-fosforowego). Po spryskaniu chromatogram suszyć w suszarce o temperaturze 110°C przez 10 min. Akiozy pojawią się w postaci brunatnych plam.

Przygotowanie roztworu do chromatografii. Ekstrakcję cukrowców z badanego produktu przeprowadzić octanem etylu. Cukry nie są rozpuszczalne w octanie etylu i dlatego też zbiera się warstwę wodną. W zależności od przewidywanego stężenia cukrów we frakcji wodnej należy zastosować rozcieńczanie prób lub zagęszczanie (temperatura do 55° C, pod zmniejszonym ciśnieniem). Przygotowaną w ten sposób próbkę ekstrahować bezwodnym etanolem w takiej ilości, aby stężenie końcowe etanolu wynosiło ok. 75%. Ekstrakt etanolowy należy odwirować.

Nanoszenie próbek i rozwijanie chromatogramu. Na dwa paski bibuły Whatman nr 1 lub nr 4 nanieść na punkty startowe 0,002 - 0,005 cm³ chromatografowanej próbki i roztworów wzorcowych cukrów (1%). Po wysuszeniu plam naniesionych próbek rozwijać chromatogram techniką spły-

wową, stosując jeden z podanych układów rozwijających. Jeżeli mieszanina zawiera więcej cukrowców, stosować chromatografię dwukierunkową.

Wywoływanie chromatogramów i identyfikacja cukrowców. Po rozwinięciu i wysuszeniu chromatogramów, spryskać je jednym z podanych rozpuszczalników. Cukrowce na chromatogramie identyfikować na podstawie barwy plam i wartości Rf plam uzyskanej dla substancji badanej w porównaniu z substancjami wzorcowymi.

Metody chromatografii cienkowarstwowej

1.    Żel krzemionkowy G według Stahla typ 60.

2.    Roztwory wzorcowe cukrów (1%).

Układy rozwijające:

1)    w-butanol-aceton-woda (7:2:1)

(glukoza, fruktoza, sacharoza, maltoza, laktoza);

2)    chromatografia dwukierunkowa

a)    n-propanol-octan etylu-woda (7:1:2),

b)    aceton-85°/o kwas mrówkowy-etanol (3:1:1),

3)    izopropanol-octan etylu-woda (1:2:3).

Układy wywołujące:

1)    Odczynnik dwufenyloanilinowy. Zmieszać 10 cm³ 2°/o roztworu dwu-fenyloaminy w 95% etanolu i 10 cm³ 2% aniliny w 95% etanolu oraz 2 cm³ 85% kwasu ©-fosforowego;

2)    Odczynnik wanilinowy. Rozpuścić 250 mg waniliny w 10 cm³ etanolu oraz dodać 0,5 cm³ stężonego kwasu siarkowego.

Tabela 1S. Wartości Rg i zabarwienie niektórych cukrowców

Cukier	Wartość Rg	Zabarwienie pla 5-dwufenyloaminą	m po spryskaniu waniliną
Ramnoza	1,32	zielone	czerwonobrązowe
Ksyloza	1,25	fioletowe	brązowe
Arabinoza	1,08	fioletowe	brązowe
Sorboza	1,06	brązowe	niebieskozielone
Glukoza	1,00	niebieskoszare	ciemnobrązowe
Mannoza	1,00	niebieskoszare	ciemnobrązowe
Fruktoza	<*90	brązowoczerwone	niebieskoszare
Galaktoza	0,80	niebieskoszare	ciemnobrązowe
Sacharoza	<*75	szare	niebieskoszare
Celobioza	0,69	niebieskoszare	szare
Furanoża	0.69	ciemnobrązowe	niebieskoszare
Trehaioza	0,63	niebieskoszare	szare
Laktoza	0,42	niebieskoszare	ciemnobrązowe
Rańnoża	0l39	szare	niebieskoszare

181