img113 3

Tabela 4.13. Najczęściej stosowane złoża <lo chrumafogiNni oilil/iulywań hydrofobowych (HIC). (wp

katalogów Amcrslmm Pharmacia Riotcch i Bio Rml na i |

	Phenyl	liulyl	Oclyl	Methyl	Butyl
	Sepharose 6FF*	Sepharose 41T	Sępim rosę 4FI''	Macro-Prcp	Macro-Pn p
Rodzaj ligandu Gęstość powierzchnio-	fenyl	/i-butyl	n-oktyl	metyl	/-butyl
wa ligandu (pmol/ml żelu)	20/40	50	5	brak danych	brak danyi h
Rodzaj nośnika	sieciowana	sieciowana	sieciowana	metakryl	metakryl
	agaroza (6%)	agaroza (4%)	agaroza (4%)
Maksymalne
ciśnienie pracy złoża (MPa)	0.3	0.3	0.3	0.1	0.1
Pojemność wiązania
(mg/ml)**	24/36	27	15	25	15

• Dane dla złóż o małej i dużej gęstości powierzchniowej ligandu (Iow,''high sub). *• Pojemność wiązania podano w mg BSA na miłilitr żelu.

protein liquid chromatography — szybka chromatografia cieczowa białek) lub MIM ( (high performance liquid chromatography — wysokosprawna chromatografia cieczo wa). Dla tych systemów przewidziano złoża, których nośniki charakteryzuje się lepszymi parametrami mechanicznymi.

Ćwiczenie 4.34. Rozdzielanie a-laktoalbuminy i /Maktoglobuliny z zastosowaniem zlo ża Phenyl Sepharose (L. Lindahl, H.J. Vogel 1984: Anal. Biochem140:394 402)

Zasada: Wiele białek podlega znacznym zmianom konformacyjnym w obecności jonów metali. Zmiany te, poza regulacją funkcji tych białek, prowadzą do zmian ich właściwo ści hydrofobowych. Zjawisko to wykorzystuje się do izolowania i oczyszczania biali ) wiążących się z jonami metali. Dwie proteiny obecne w mleku, a-laktoalbuminn i /Maktoglobulina, mają zdolność wiązania jonów Ca²⁺. Obecność jonów micri/i powoduje, że a-laktoalbumina jest mniej hydrofobowa niż w środowisku ubogim w t. jony. Właściwości hydrofobowe /Maktoglobuliny są słabo zależne od obecności jonów miedzi. Z tego powodu można stosunkowo łatwo dokonać separacji tych dwóch biali 1 wykorzystując złoże Phenyl Sepharose. W pierwszym etapie chromatografii pr/e/ kolumnę przepuszcza się mieszaninę tych białek w obecności EDTA. W tych warun kach a-laktoalbumina wiąże się ze złożem, podczas gdy /Maktoglobulina przepływa przez kolumnę prawie bez oddziaływań. W drugim etapie wystarczy wyeluować /aa«l sorbowane białko, korzystając z buforu zawierającego jony wapnia.

Materiał: Białka a-laktoalbumina i /Maktoglobulina.

Odczynniki:

1)    Phenyl Sepharose 6FF.

2)    Bufor: 50 mM Tris/HCI - 0.2 M EDTA (pH 7.5).

3)    Bufor: 50 mM Tris/HCI - I mM CaCI2 (pH 7,5).

4)    20% roztwór etanolu.

Wykonanie: Zmieszać 5(X) ul (2 mg/ml) a-laktonlbwminy / 500 ul (2 mg/ml) /Maktoglobuliny i dodać I ml buforu Tris/HCI 0,2 M EDTA. Inkubować w temperaturze pokojowej w czasie 30 min. W tym c/asie pobrać 5 ml złoża Phenyl Sepharose 6FF, przemyć 3-krotnie w 20 ml H₂0, i upakować w plastikowej kolumnie. Przepuścić przez kolumnę 50 ml buforu Tris/HCI - EDTA. Na tak przygotowaną kolumnę nanieść wcześniej przygotowaną próbkę mieszaniny białek i rozpocząć zbieranie materiału wypływającego z kolumny (frakcje po 2 ml). Po wniknięciu naniesionej próbki w złoże, kolejno przepuścić przez kolumnę 15 ml buforu I ris/HCl - EDTA oraz 50 ml buforu Tris/HCI - CaCl₂, pamiętając cały czas

0    zbieraniu wypływającego z kolumny materiału w 2-mililitrowych frakcjach i spck-trofotometrycznym oznaczaniu w nich zawartości białka. W tych warunkach /Maktoglobulina powinna opuścić kolumnę bez oddziaływań i znaleźć się we frakcjach o numerach 2 i 3, natomiast a-laktoalbumina powinna być wyeluowana wtedy, gdy EDTA zostanie usunięte z kolumny, a jego miejsce zajmą jony Ca²'

tj. we frakcjach powyżej numeru 8. Po zakończonej pracy kolumnę przemyć wodą destylowaną (50 ml) oraz 20% etanolem (15 ml) i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed ponownym użyciem wystarczy kolumnę przemyć za pomocą 50 ml H₂0.

Ćwiczenie 4.35. Izolowanie enzymów z ich mieszaniny z zastosowaniem złoża Phenyl Sepharose (L. Szepesy, C. Horvath 1988: Chromatographia, 26:13-18)

Zasada: Obecność dużych stężeń soli w roztworze białek wywołuje liczne zmiany konformacyjne tych białek. W krańcowych przypadkach zmiany te prowadzą do wytrącenia niektórych białek z roztworu. Zjawisko to (wysalanie białek) często stosowane jest do szybkiej i wstępnej separacji białek. Pozostałe w roztworze białka wykazują silne właściwości hydrofobowe i można je rozdzielać stosując technikę chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC). Po naniesieniu na kolumnę mieszaniny białek, znajdujących się w środowisku o dużym stężeniu soli, dojdzie do oddziaływania hydrofobowych fragmentów tych białek z hydrofobowymi łańcuchami ligandów związanych trwale z nośnikiem. Po odmyciu niespecyficznie zaadsor-bowanych białek można eluować związane białka zależnie od ich hydrofobowości, stosując eluenty o malejącym stężeniu soli.

Materiał: Białka wzorcowe cytochrom c, mioglobina, rybonukleaza oraz chymotrypsynogcn A. Odczynniki:

1)    Phenyl Sepharose 6FF.

2)    50 mM bufor fosforanowy (pH 7,0).

3)    50 mM bufor fosforanowy — 1.7 M (NH₄)₂S0₄ (pH 7,0).

Wykonanie: Przygotować w buforze fosforanowym, zawierającym 1,7 mol/l (NH₄)₂S0₄, mieszaninę białek standardowych: cytochrom c (2 mg/ml), mioglobinę (4 mg/ml), rybonukleazę (10 mg/ml), chymotrypsynogen A (3 mg/ml). Pobrać 5 ml złoża Phenyl Sepharose 6FF, przemyć 3-krotnie wodą destylowaną (porcje po 20 ml)

1    upakować w plastikowej kolumnie. Kolumnę zrównoważyć buforem fosforanowym. zawierającym 1,7 mol/l (NH₄)₂SQ₄ (50 ml). Korzystając z wyjściowych

171