img117 2

hic wzorcowej powinny pojawić się dodutkown \ s/i/yty chromatograficzne od powiadające: paracciamolowi (ok. 4 min), toofilinU* (ok. 7 min) oraz salicylanowi (ok. X min). Standard wewnętrzny powinien się pojawić dokładnie w tym samym miejscu, co w osoczu wolnym od Icków. W próbie badanej, o nieznanej zawartości leków szczyty chromatograficzne poszczególnych leków powinny pojawić się przy tych samych czasach retencji co w osoczu wzorcowym, ale mogą być różnej wysoko ści. Wysokość szczytu zależy od stężenia danego leku w osoczu. W zakresie badanyt li stężeń oraz mierzonych przez detektor zmian gęstości optycznej przepływającej cicc/y, można przyjąć liniową zależność mierzonej gęstości optycznej od stężenia każdego z leków. Uwzględniając wartości absorbancji uzyskane dla wewnętrznego standardu w rozdziałach próby wzorcowej oraz badanej, można policzyć stężenie (c) każdego z analizowanych leków w próbie badanej, korzystając ze wzoru:

^Icku ^— ^wzorca Icku Icku próbyIcku wzorca) (^srandardu wzorca/ ^Mandardu próby)

gdzie: c,_cku i c_wzorcaleku — stężenia badanego leku, odpowiednio w osoczu badanym i wzorcowym; /l_ttuprtty i >l|_Cku^_orca zmierzone wartości maksymalnej absorbimcjl w szczycie badanego leku, odpowiednio w próbach badanej i wzorcowej, ^.undardu wzorca » Standardu próby “ zmierzone wartości maksymalnej absorbancji \s s/i zy cic odpowiadającym standardowi wewnętrznemu, odpowiednio w próbach wzoru» wej i badanej.

Po zakończeniu oznaczeń przemyć kolumnę 20% roztworem metanolu (30 mli i przechowywać w temperaturze pokojowej, szczelnie zamkniętą z obu końców lub podłączoną do systemu HPLC.

Ćwiczenie 4.38. Oznaczanie techniką HPLC zawartości 5-metylo-2'-deoksycytydyii\ i 2'-deoksycytydyny w enzymatycznych hydrolizatach DNA (patrz ćw. 10.32).

Piśmiennictwo

Bloch K., Snoke J.E. 1957: Glutathionc — isolation and determination. [in] Methods in enzyinol>uiV, vol. 3. S.P. Colowick, N.O.Kaplan (cds), Acadcmic Press, New York, p. 603-606.

Chcaais F., Yirella G., Patrick C.C., Fundenberg H.H. 1977: Isolation of solublc immune co m pic nos by afUnity chromatography using staphylococcal protein A Scpharosc as substrate. J. Immunol. Method^ 18:183 192.

Ciornicwski C.S., Bud/.ynski A.Z. 1993: Localization of the cross-linking sitc of GPRWERHK iii ilu) y-chain of human fibrinogen. Eur. J. Biochem., 218:321-325.

Cicrnicwski G&, Świątkowską M., Poniatowski J., Niewiarowska J. 1988: Anti-(Arg-Gly-Asp-Sci I mi tibody and its intcraction with fibronectin, fibrinogen and platclcts. Eur. J. Biochem.. 177:109 11 Consden R., Gordon A.II., Martin A.J.P. 1944: Qualitative analysis of protcins: a partion chromatography method using paper. Biochem. J.. 38:224 232.

Cuatrecasas P. 1970: Agarosc dcrivatcs for purification of protein by aflinity chromatography.

228:1327 1328.

Cuatrecasas P., Anfinsen C.B. 1971: AfTinity chromatography. Annu. Rev. Biochem.. 40:259 278. (uatrccasas P., Wilchck M., Anfinsen C.B. 1968: Sclectivc cnzymc purification by aflinity chromatogm phy. Proc. Natl. Acad. ScL USA. 61:636 643.

Dcuel II., Solms .1., Anyas-Wcis/ I.. 1950: Ober das Vcrhaltcn loslichcr Polyclcktrolyte gcgcntll" • loncnatistuuschcrn. Helv. Chim. Acta, 33:2171 2178.

Deutsch !>.<•.. Merty. K.T. 1970: Plazminogen: Purification froni hiim.in pliomni by aflinity chromatography. Science, 170:1095 1096.

Kr-el Zaidenzaig Y., Shalticl S. 1972: Hydrocarbon-coatcd ncphuroso*. IJsc in thc purification of

glycogcn phosphorylasc. Biochem. Biophys. Res. Commun., 49 .183 390.

Ey P.L., Prowse SJ., Jenkin C.R. 1978: Isolation of purc IgGI, lgG2a and Ig(i2b immunoglobulins from mousc serum using Protein A Scpharosc. I mmunochemistry, 15:429 436.

Filipowicz B., Więckowski W. 1973: Biochemia., t. I. PWN, Warszawa. 509 ss.

Fischer I- 1980: Gel fihration chromatography. Elsevicr/North-Holland Biomcdical Press, Amsterdam.

269 ss.

Flodin P. 1962: Dextran gels and their applications in gel Jiltration. Pharmacia, Uppsala, 85 ss.

Iljerten S. 1973: Somc generał aspects of hydrophobic interaction chromatography. J. Chromatogr.. 87:

325-331.

James A.T., Matrin AJ.P. 1952: Ga$-liquid partition chromatography the separation and micro-estimation of volatilc fatty acid from formie acid to dodccanoic acid. Biochem. J.. 50:679 690.

Johns E.W'., Phillips D.M.P., Simson P_M Butler J.A.V, 1960: Improvcd fractionation of arginine-rich histones from calf thymes. Biochem. J., 77:631-636.

Kahlenberg A., Walker C. 1976: Prcparativc isolation of band 3, thc predominant polypcptidcs of thc human crythrocytc membranę. Anal. Biochem.. 74:337 342.

Kirkland JJ. (red.) 1976: Współczesna chromatografia cieczowa, (tłum. z ang. R. Dybczyński i I. Fidclis), PWN. Warszawa, 326 ss.

Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.) 1982: Ćwiczenia z biochemii, wyd. 3, PWN, Warszawa Poz.nań, 614 ss. Iwimkin G.E., King E.E. 1976: Bluc Scpharosc: a rcusablc afTinity chromatography medium for purification of alcohol dchydrogcnasc. Biochem. Biophys. Res. Commun.. 72:560 565. l-ederer C, 1-ederer M. 1957: Chromatography. A review of principles and applications. Elscvier Publ. Com., Amsterdam, 711 pp.

I.indahl L., Vogel HJ. 1984: Mctal-ion-depcndcnt hydrophobic-intcraction chromatography of a-lactalbumins. Anal. Biochem., 140:394 402.

Martin AJ.P., Synge R.I-M. 1941: 151. A new form of chromatogram employing two liquid phases. I. A theory of chromatography. 2. Application to thc micro-dctcrmination of thc higher monoamino-acids in protcins Biochem. J., 35:1358 1368.

Melander W'., Horvath C. 1977: Salt cfTccts of hydrophobic intcractions in prccipitation and chromatography of protcins: an interpretation of thc lyotropic series. Arch. Biochem. Biophys., 183:200 215. Moore S., Stein W. 1948: Photomctric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem., 176:367-388.

Moore S„ Stein W.M. 1951: Chromatography of amino acids sulfonated polystyrcnc resins. J. Biol. Chem . 192:663 681.

Nohara H., Takahashi T., Ogata K. 1968: Enzymatic acctylation of histones and somc Chemical charactcrs of their acetyl groups. Biochim. Biophys. Acta, 154:529-539.

Opieńska-Blaut J., Waksmundzki A., Kański M. (red.) 1957: Chromatografia. PWN, Warszawa, 1083 ss. Opieńska-Blaut J„ Kraczkowski H., Brzuszkicwicz H. 1967: Zarys chromatografii cienkowarstwowej. PWRiL, Warszawa, 320 ss.

Polson A. 1961: Fractionation of protein mixturcs on columns of granulatcd agar. Biochim. Biophys. Acta, 50:565 572.

Porath J., Carlsson J., OLsson I., Belfrage G. 1975: Metal chelatc afTinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Naturę, 258:598 599.

Porath J., Flodin P. 1959: Gel filtration: a method for desalting and group separation. Naturę. 183:1657-1659.

Reid R.L., I^derer M. 1951: Separation and estimation of saturated C₂ C₇ fatty acids by paper partition chromatography. Biochem. J., 50:60 67.

Schweiger A., Mazur G. 1976: Isolation and characterization of a soluble protein from Ehrlich ascites carcinoma celi cytoplasm with a high afTinity for polyadenylatc. Z. Physiol. Chem. Hoppe Seylers, 357:481 485.

179