IMGT41

tej sterylizacji nie stosuje się. Do sterylizacji zewnętrznej stosuje się obecnie najczęściej podchloryn wapnia lub sodu, wodę utlenioną lub bromową, formaldehyd lub sublimat (HgCI₂). Następnie płucze sięeks-plantat 3-4-krotnie w sterylnej wodzie destylowanej. W takiej wodzie pozostawia się eksplantaty do momentu wyłożenia na pożywkę.

| Inokulacja polega na wyłożeniu eksplantatu na pożywkę. W żargonie laboratoryjnym określa się tę czynność jako „wyszczepianie". Eksplantat umieszcza się w pożywce polarnie ( 4), apolarnie (T) lub horyzontalnie (.<->), Pierwszy sposób wspomaga namnażanie pędów rozetowatych, drugi sprzyja regeneracji cebul przybyszowych, trzeci stosowany jest przy rozkrzewianiu roślin z pąków bocznych.

| Restytucja rośliny może być częściowa, gdy sprowadza się tylko do regeneracji jednego lub kilku pędów, albo całkowita - gdy obejmuje odtworzenie pędu i korzeni.

Etap drugi - namnażanie nazywa się również proliferacją albo multi-plikacją, trwa 3-4 tygodni. Polega on na dzieleniu zregenerowanych pędów na mniejsze fragmenty i przenoszeniu na świeżą pożywkę. Przenoszenie roślin lub ich części z pożywki na pożywkę nazywa się pasażowaniem.

Etap trzeci - ukorzenianie mikrosadzonek - trwające około 2 tygodni może być odrębnym etapem lub stanowić część etapu drugiego. Obecnie coraz częściej ukorzenianie mikrosadzonek przenosi się do szklarni - mno-żarki i przeprowadza w warunkach in vivo. Tak jest po prostu taniej.

Etap czwarty - adaptacja (aklimatyzacja), obejmuje przygotowanie mikrosadzonek do warunków in vivo. Może on przebiegać w laboratorium lub od razu w szklarni - mnożarce. Trzeba teraz przywrócić roślinom sprawność autotroficzną i uodpornić na stresy: świetlny, wodny i termiczny. W laboratorium zwiększa się w związku z tym na tydzień natężenie oświetlenia, z kilku i do kilkunastu tysięcy luksów, a w szklarni zmniejsza I przez cieniowanie i zamgławianie mikrosadzonek; obniża się także temperaturę i zwiększa wilgotność powietrza. Najpierw jednak otwiera się słoje, wypłukuje mikrosadzonki z agaru i sadzi do sterylnego podłoża. Następnie przykrywa się je w szklarni osłonami foliowymi.

Mikrosadzonki są bardzo delikatne, szparki są otwarte, a liście nie mają kutykuli. Stąd konieczność zastosowania opisanej procedury pielęgnacyjnej.

6. Witryfikacja

Witryfikacja jest chorobą fizjologiczną roślin rozmnażanych in vitro w laboratoriach. Jest groźna zwłaszcza dla masowo w Polsce produkowa-

nych sadzonek gerbery. Nie oszczędza również innych gatunków roślin, niezależnie od tego czy są to rośliny ozdobne, warzywa, podkładki drzew i krzewów owocowych itp.

Sadzonki z wyraźnymi objawami tej choroby źle znoszą przenoszenie do szklarni i przesadzanie. Często zamierają bez widocznej przyczyny i wypadają kilka dni po posadzeniu do doniczek nawet wówczas, gdy odpowiednio dla nich dobrane podłoże jest sterylne (torf, piasek, perlit, wełna mineralna) i nie zawiera żadnych patogenów. Wzorowa pielęgnacja sadzonek w szklarni też nie jest w stanie temu zapobiec.

Witryfikacja pojawia się bardzo wcześnie, gdy całe rośliny lub ich fragmenty są jeszcze zamknięte w naczyniach szklanych, w których rosną i rozmnażają się na pożywkach odżywczych. Objawy choroby są bardzo wyraźne. Pędy stają się szkliste, cienkie i błyszczące; barwa liści ulega rozjaśnieniu, ogonki i blaszki liściowe wydłużają się, a niekiedy również skręcają nieregularnie; skórka łodyg i liści traci ochronną warstwę skutynizowanego nabłonka (kutykuli); wcześniej jeszcze zanika na nabłonku nalot woskowy. Objawom tym towarzyszą zaburzenia w funkcjonowaniu aparatów szparkowych, utrata wody przez komórki, zwiększenie ilości wody w przestrzeniach międzykomórkowych, zanik juwenilności (młodzieńczości) i wigoru eksplantatów.

W rezultacie drastycznie maleje współczynnik namnażania pędów; | gerbery, nawet do 1-2, co czyni laboratoryjną produkcję sadzonek zupełnie nieopłacalną. Niezależnie od tego obniża się jakość mikrosadzonek i ich zdolność do ukorzeniania się. U nasady pędów tworzy się ponadto niepotrzebnie kalus.

Czynniki sprzyjające witryfikacji są następujące;

1 niedobór światła,

I zbyt wysoka temperatura,

| słabo zestalony agar w pożywce,

I zbyt niskie pH pożywki,

I podwyższona wilgotność powietrza w naczyniu,

*    nadmierne stężenie cytokinin,

I użycie benzyloadeniny (BA) w miejsce kinetyny, i wielokrotne pasażowanie roślin,

1 nadmierne zagłębienie eksplantatu w pożywce,

| pożywka płynna,

*    pożywka Murashige'a i Skooga-74 (bardziej niż inne!). Witryfikacja jest niestety zjawiskiem nieodwracalnym. Rośliny z widocznymi, typowymi objawami tej choroby fizjologicznej należy niezwłocznie wyeliminować z dalszej produkcji w laboratorium. Jedynym ratunkiem

93