PHOTO40

RAPD (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA)

Technikę tę rozpoczęto stosować na początku lat 90-tych. Wykorzystuje ona reakcję PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) do generowania markerów RAPD. Markery te wykazują dominujący charakter dziedziczenia, przez co niemożliwe jest odróżnienie homozygot od heterozygot. Do reakcji PCR używa się startera o długości 9-11 pz. Każdy taki starter zapoczątkowuje amplifikację w wielu rejonach genomu jednocześnie. Produkty reakcji amplifikacji rozdziela się na żelu agarozowym. Detekcja prążków odbywa się z użyciem znaczników fluoroscencyjnych lub srebra. Metoda ta jest szybsza, wydajniejsza i mniej pracochłonna od RFLP. Potrzeba również znacznie mniejszych ilości DNA, ponieważ jest on powielany w kolejnych rundach amplifikacji. DNA ten może pochodzić z surowego ekstraktu. Przy markerach RAPD możliwe jest rozróżnienie homozygot i heterozygot przez zastosowanie krzyżowania wstecznego i wsobnego. Powoduje to jednak znaczne wydłużenie czasu analiz. Drugim sposobem różnicowania alleli jest DGGE (ang. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). W wyniku elektroforezy we wzrastającym stężeniu czynnika denaturującego allele heterozygot denaturują inaczej niż homozygot, co przejawia się odmienną ruchliwością elektroforetyczną.

RAPD - jest to metoda losowej amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA, wykorzystywana w analizie podobieństwa szczepów drobnoustrojów.

W metodzie tej stosuje się jeden losowo dodany starter oligonukleotydowy (10 lub 20 nukleotydowy, o dużej ilości zasad G i C).

Dwa pierwsze cykle amplifikacji przeprowadza się w stosunkowo niskiej temperaturze przyłączania startera (Ta = 35-450C), co umożliwia hybrydyzację startera do sekwencji matrycowych, nie będących w 100% homologicznymi.

Kolejne cykle amplifikacji (ok. 30-40) zachodzą przy właściwej dla startera Ta.

Ponieważ DNA różnych szczepów różni się między sobą, po rozdzieleniu na żelu uzyska się wzór prążków charakterystycznych dla każdego ze szczepów analizowanych.

Podobieństwo wzorów uzyskanych w tym teście pozwala na ocenę pokrewieństwa badanych szczepów.

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimeryzacji, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Technika wynaleziona w 1983 roku przez Kary Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus.

Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery oraz termostabilną polimerazę (może nią być na przykład polimeraza Tag wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych). W wyższej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-70°C), przyłączają się one do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimeraza DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2" cząsteczek. W praktyce wydajność jest mniejszą co nie zmienia faktu, że metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, pracach nad gatunkami, które wyginęły.

Stosuje się również modyfikacje metody PCR m.in:

• RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie DNA natnnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji