sprawko zel 4

Następnie pobrano 9 różne próbki roślinne i każdą z nich umieszczono w moździerzu zawierającym bufor zagęszczający o pH=6,8. Składniki roztarto na jednolitą masę, umieszczono w probówkach Eppendorfa:

5 pi- próbki gęste 10 ^xl-próbki ciekłe

odwirowano i przechowywano w lodówce- utworzył się front wędrujących białek.

Dwa rodzaje żel przygotowano poprzez zmieszanie ze sobą następujących substancji: Górny żel: uszczelniający, zagęszczający

-    4,6 ml wody

-    1,34 ml akrylamidu (tworzy polimery)- roztwór A

-2,0 ml buforu (który pozwala na przepływ prądu) - roztwór C zel zagęszczający

-    100 pil nadsiarczanu i 10 pi TMD (katalizują polimeryzację)- błękit bromofenolowy

Dolny żel: rozdzielający

-    8,3 ml wody

-    6,7 ml akrylamidu (tworzy polimery)- roztwór A

-    5,0 ml buforu (który pozwala na przepływ prądu) - roztwór B rozdzielający

-    100 pi nadsiarczanu i 10 pi TMD (katalizują polimeryzację)- błękit bromofenolowy

Zastosowanie do elektroforezy dwóch rodzaj ów żeli:

(zagęszczającego i rozdzielającego) różniących się zarówno pH jak i wielkością porów pozwala na dobry rozdział białek. Typ elektroforezy, w której bufor w żelu i bufor elektrodowy (rozwijający) różnią się pH, nosi nazwę elektroforezy nieciągłej ang. discontinuous. Stosuje się ją częściej do rozdziału białek w przeciwieństwie do elektroforezy ciągłej ang. continous, w której bufor w żelu i bufor elektrodowy mają takie samo pH.

Znaczenie żelu zagęszczającego:

Po włączeq[u dopływu prądu, naładowana ujemnie

glicyna w buforze rozwijającym (pH 8,3) „ucieka” od ujemnie naładowanej elektrody w kierunku żelu zagęszczającego i prób. Jednak panujące tu znacznie niższe pH (6,8) sprawia, że cząsteczki glicyny tracą większość swoich ujemnych ładunków, co zmniejsza ich ruchliwość. Jony chlorkowe znajdujące się w żelu zagęszczającym i w próbach także przemieszczają się w kierunku elektrody dodatniej. Zachowanie obu rodzajów jonów powoduje, że tworzy się wąski obszar o małym przewodnictwie (czyli bardzo wysokiej oporności) na początku żelu zagęszczającego Białka w pobliżu punktu izoelektrycznego-zawiera średnio-tyle samo ładunków -dodatnich co ujemnych, na skutek czego ładunek całkowity całej populacji wynosi zero (+)

W żelu rozdzielającym wszystko się zmienia, panuje tu wyższe pH (8,8) i glicyna staje się naładowana bardziej ujemnie, co powoduje, że zwiększa się jej ruchliwość, natomiast ruchliwość białek zmniejsza się dzięki działaniu żelu jako sita. W rezultacie glicyna nie utrzymuje już białek w wąskim obszarze o wysokiej oporności i dużym natężeniu pola elektrycznego. Teraz białka znajdują się w jednorodnym polu elektrycznym i poruszają się we własnym tempie; następuje ich rozdział według masy cząsteczkowej, bialko(-) wędruję do elektrody (+)