sprawko zel 3

Pipetą nanoszono próbki do studzienek (po 5 i 10 pl). Elektroforezę prowadzono do momentu, gdy błękit znalazł się 0,5 cm od dolnej krawędzi żelu.

Żel wyciągnięto i poddano barwieniu histochemicznemu na obecność diaforaz zależnych od NADPH. Barwienie wykonano by uwidocznić prążki.

diaforaza katalizuje przeniesienie H⁺z NADH/H⁺na tetrazolonę, która ulega redukcji do formazanu. Metoda ta pozwala w sposób prosty i jednoznaczny określić czy dana substancja powoduje uszkodzenie błony plazmatycznej komórek, a w konsekwencji ich śmierć.

BARWIENIE:

Białka w żelach poliakrylamidowych można wykrywać przy pomocy barwników lub fluorochromów łączących się specyficznie z białkami (Commasie, SyproRuby) lub przy pomocy reakcji chemicznych prowadzących do powstania barwnych produktów. Reakcje takie mogą niespecyficznie wykrywać białka (np. barwienie żeli srebrem) lub opierać się na specyficznej reakcji katalizowanej przez określone białko enzymatyczne (wykrywanie enzymów w żelach po elektroforezie natywnej).

Barwienie    srebrem

Istnieje wiele protokołów wyznakowywania białek srebrem (AgN03). Metody te można podzielić na działające w środowisku kwaśnym i zasadowym. W środowisku kwaśnym jony srebra reagują z grupami karboksylowymi aminokwasów. W środowisku zasadowym jony srebra reagują z grupami aminowymi. W obu przypadkach jony srebra zostają zredukowane i pozostają w żelu jako koloidalne srebro. Metoda ta jest znacznie czulsza niż barwienie Coomassie - pozwala na wykrycie kilku ng białka w prążku. Barwienie srebrem pozwala na ilościową analizę densytometryczną żeli, jednak zakres dynamiczny tej metody jest mniejszy niż w przypadku barwienia Coomassie czy SyproRuby.

Wyniki _f

Zdj. 1 - Otrzymany układ prążków.

Na wybarwionym żelu zaobserwowano różnice w aktywności białek na podstawie różnego położenia prążków zależności od gatunku z którego pochodził analizowany materiał roślinny. Prążki są tutaj odpowiednikami izoenzymów.

1 .paproć

2.    nagozalążkowy świerk

3.    dąbrówka

4.    mniszek

5.    Arabidopsis thaliana

6.    Arabidopsis Columbia

7.    Arabidopsis arenosa

8.    Arabidopsis thaliana TL3