(6)

Wlać natychmiast mieszaninę do uprzednio przygotowanego zestawu szybek aparatu do elektroforezy tak, by utworzyła się na dnie warstwa ok. 0.5 cm. Po jej spolimeryzowaniu dodać do pozostałej części przygotowanego roztworu 150 pl r-ru nadsiarczanu t 15 pl TEMED-u i wlać do aparatu do wysokości ok 2 cm od górnej krawędzi szyb. Na roztwór między szybkami nanieść ostrożnie ok. 1 cm warstwę wody, co powoduje wyrównanie powierzchni żelu

Przy wszystkich operacjach zachowywać ostrożność, ponieważ niespolimeryzowany akrylamid jest silną netirotoksyną. Strzykawki, igły itp. natychmiast po użyciu wypłukać zimną wodą aby zapobiec polimeryzacji akrylamidu w nich.

Po ok. 60 min. odsączyć z powierzchni żelu wodę i wlać uprzednio przygotowany roztwór dla otrzymania żelu zagęszczającego o składzie

woda    4.6    ml

roztwór A    1.34    ml

roztwór C    2    ml

r-r nadsiarczanu 100    pl

TEMED    10 pi,

postępując zgodnie z przepisem dotyczącym danego typu aparatu

Roztwór do barwienia histochemicznego diaforaz:

DC1P    5    mg

MTT    7.5    mg

rozpuścić w 50 ml buforu 0.025 M Tns-HCl, pH 8.5

Bezpośrednio przed barwieniem w 20 ml tego roztworu rozpuścić

NADH lub NADPH*    4    mg (przygotować wcześniej naważkę w eppendorfce)

• odpowiednio dla diaforaz zaJcZnych od NADI1 lub NADPH

%

Barwienie wszystkich białek srebrem A: tri przez GO min utrwalać w kąpieli odwadniające) metanol    IW ml

kwas octowy    24    ml

formalina 37%    IW    pl

woda    76    ml

13: Płukać w 50% etanolu przez 20 rnin. 2 razy, zmieniając roztwór. C: Zanurzyć 2el w ro/1 worze 40mg Na₂S₂Oj • 5H₂0 na 1 min.

D: Płukać wodą destylowaną 3 x po 20 s E: umieścić zzi w kąpieli impregnującej na 20 tuiu AgNOj    400 mg

formalina 37%    150 pl

woda    200    ml

F: Płukać wodą dcsL 2 x jx> 20 s.

G: Wywoływać w toztworze:

Na₂C0₃ r-r z pfctu C formalina 37% woda

■{ ml 0.1 ml 195 ml

pracz 10 mm

l i: Płukać 2x w wodzie dest przez 2 min I: Umieścić w kąpieli przerywającej;

loctanol    50 ml

kwas octowy    12 ml

woda    38 rrJ

na 10 min

J: Płukać w 50% r-rzc metanolu pracz co najmniej 20 min. W tej kąpieli Zcl n»o2* pozostawać przez dkr&zy czas.

Sprzęt

Dwupłytkowy aparat do elektroforem Moździerz z kurantem

Pudlo styropianowe lub termos na ciekły azot Szalki Pctriego $ = 8 - 10 czn.

c.