003

Przebieg reakcji syntezy L-DOPA można łatwo śledzić oznaczając spektrofotometrycznie przyrost produktu reakcji w czasie poprzez przekształcenie L-DOPA w barwną, dinitro-chinonową pochodną, zgodnie z reakcją :

0₂N ^Y^O

R,

HNOj H

OH

L-DOPA    dinitro L-DOPA    dinitro-dopachinon

(barwa zolta)    (barwa czerwono-pomaranczowa)

Rys. 4 Zasada spektrofotornetryczncgo oznaczania L-DOPA [2,3]

Uwaga: l) w środowisku reakcji nie może być. poza L-DOPA, innych difenoli; mono--fenole (L-tyrozyna) nie przeszkadzają w reakcji 2) Ponieważ tyrozynaza katalizuje reakcją utleniania L-tyrozyny przy udziale tlenu cząsteczkowego (Rys. 2) próby musza być dobrze mieszane (nie stosować wąskich probówek) celem zapewnienia dobrego napowietrzenia

Celem ćwiczenia jest poznanie metody izolacji i oczyszczania tyrozynazy z pieczarki dw-uzarodnikowej, oznaczania aktywności tego enzymu i jego wykorzystanie do enzymatycznej produkcji L-DOPA

2. Część eksperymentalna 2.1. Materiały i odczy nniki:

1.    Owocniki pieczarki : 150 g świeżych owocników^r pokroić na małe kaw-ałki, umieścić w woreczku foliowym i zamrozić przez noc w -20°C

2.    Aceton (oziębiony do - 20°C)

3.    Siarczan amonu (stały), roztarty

4.    0,1 M bufor fosforanowy o pH 7,0 (oziębionyw lodzie)

5.    Mieszanina reakcyjna (inkubacyjna):

2,5 mM L-tyrozyna i 7,5 mM L-askorbinian w 0.1 M buforze fosforanowym,pl l 7

6.    2,0 M roztwór NaOH

7.    2,0 M roztwór HC1

8.    15% roztwór molibdenianu sodu

9.    15% roztwór azotanu(III) sodu (azotyn sodu)

10.    Mieszanina odczynnika „8” i „9” - bezpośrednio przed użyciem zmieszać równe objętości obu odczynników

11.    10,0 mM wzorcowy roztwór L-DOPA w mieszaninie reakcyjnej (5)

12.    Odczynnik Bradford do oznaczania białek

13.    Standardowy roztwór albuminy (lub owoalbuminy) o stężeniu 1,0 mg / ml

2.2.1. Ekstrakcja i oczyszczanie tyrozynazy

Wskazane jest, aby całą procedurę izolacji i oczyszczania tyrozynazy przeprowadzić w temperaturze około 4°C ( w chłodni ).

Przebieg postępowania przedstawiono na Schemacie 1:

3