005

2.2.2. Ekstrakcja i oczyszczanie tyrozynazy metodą uproszczoną

Do 200 g zamrożonych i drobno pokrojonych pieczarek dodać 250 ml 0,1 M buforu fosforanowego i /homogenizować mikserem .

I

Przesączyć preparat przez bibułę Whatman Nrl pod próżnią pompki wodnej

I

Zmierzyć objętość przesączu, ochłodzić go w lodzie i dodać porcjami aceton (oziębiony do-20°C) do stężęnia 65 %. Preparat trzy mać w lodzie i po 1 godzinie odwirować osad enzymu

I

Osad enzymu rozpuścić w 120 ml 0,05 M buforu fosforanowego (ew entualny nierozpuszczalny osad odw irować)

Do brunatno zabarwionego roztworu dodać porcjami w temp. 0°C stały', drobno zmielony siarczan amonu do stężenia 70%.

Pozostawić mieszaninę w lodzie na 1 godzinę po czym odwirować OSAD ENZYMU (30 min. x 16000 x g )

OSAD ENZYMU rozpuścić w 20 ml 0,1 M buforu fosforanowego i zamrozić w -20°C

2.3.    Wykonanie krzywej kalibracyjnej dla L-DOPA

Przygotować 2x po 1,0 ml wzorcowych roztworów L-DOPA o stężeniu:

0,2 0,4, 0,6, 0,8 1,0    1,5 i 2,0 umole/ml

rozcieńczając odpowiednio standardowy roztwor L-DOPA (10 mM) mieszanina inkubacyjna

Próba ślepa (odnośnik) - 1,0 ml mieszaniny inkubacyjncj Do każdej próby dodać kolejno i wymieszać:

500 ul 2M HCf

1000 ul mieszaniny molibdenian - azotan(IIl)sodu (odcz. „10”)

1000 ul 2M NaOH

Po 10 minutach dokonać pomiaru spektrofotometTyczncgo przy X = 460 nm względem próby ślepej. Wyniki zapisać w^f tabeli.

2.4.    Enzymatyczna sy nteza L-DOPA

1.    Przygotować 8 par probówek, do każdej napipetować po 500 ul 2M HC1

2.    Do kolbki stożkowej 50 ml odmierzyć 25 ml mieszaniny reakcyjnej, umieścić kolbę na wytrząsarce (w temperaturze pokojowej),ustawić na 200 cykli/min.

Zapoczątkować reakcję przez dodanie 500 ul roztworu enzymu \ włączyć stoper.

5