image1 (3)

Ekstrakcja i oznaczanie karotcnoidów metoda otwartej kolumny

1.    Odważyć do kolby stożkowej na 100 ml 100 mg liofilizowanego produktu pomidorowego, dodać szczyptę węglanu magnezu, 1,5 ml metanolu oraz 5 ml acetonu.

2.    Odstawić w ciemne miejsce na 12 h.

3.    Ekstrahowaną naważkę liofilizatu pomidorowego przenieść na lejek Shotta (podłączony do pompy próżniowej) i przelewać acetonem (do momentu, aż spadające krople w kolbie odbiornikowej będą bezbarwne)

4.    Przenieść karotenoidy w acetonie do rozdzielacza gruszkowego na 250 ml, dodać 10 ml n-heksanu oraz 50 ml stężonego (30%) NaCl.

5.    Zamknąć rozdzielacz i mocno wstrząsnąć (trzymając uprzednio jedną ręka rozdzielacz i jedną ręką korek). Odwiesić rozdzielacz (delikatnie otworzyć korek i odgazować ekstrakt) i poczekać na uformowanie się warstwy solankowo-acetonowej (na dole) i warstwy heksanowej (na górze) rozdzielacza.

6.    Spuścić dolną warstwę solankowo-acetonową do zlewki.

7.    Zamknąć kranik rozdzielacza dokładnie na granicy warstwy heksanowej i dolać ponownie 100 ml NaCl. Czynność tę powtarzamy 10-12 krotnie, aż do całkowitego pozbycia się acetonu z rozdzielacza.

8.    Do kolbki na 50 ml wsypać szczyptę bezwodnego siarczanu sodu i następnie zlać karotenoidy rozpuszczone w heksanie (warstwa heksanowa), uzupełnić heksanem do kreski. Zamknąć koreczkiem i wymieszać (przekręcając kolbkę kilkukrotnie góra-dół.

9.    Przygotować kolumienkę chromatograficzną: wypełnić kolumienkę aktywowanym w suszarce (105°C) tlenkiem hydroksyglinu (3/4 wysokości kolumny szklanej) oraz dodać 0,5 cm warstwę bezwodnego siarczanu sodu (jako odwadniacza).

10.    Do pipety automatycznej nabrać 5 ml karotenoidów rozpuszczonych w heksanie (z kolbki na 25 ml). Założyć kolumnę na kolbkę odbiornikową i podłączyć do pompy próżniowej. Przemyć kolumienkę niewielką ilością heksanu, a następnie nanieść karotenoidy i przelewać kolumnę najpierw mieszaniną do b-karotenu, jednocześnie kontrolować podciśnienie przez regulowane włączanie i wyłączanie pompy próżniowej.

11.    Odebrać b-karoten w kolbce i przenieść go do kolby miarowej na 25 ml, uzupełnić heksanem do kreski. Zmierzyć absorbancję fali przy dł. 450 nm, zawartość b-karotenu wyliczyć ze wzoru:

1    , ,    , E*25w/*10000

betakaroten (|ig/g s.m.)= -

2505 * masa

12. Przemyć kolumnę mieszaniną do likopenu i podobnie jak w przypadku b-karotenu wypłukiwać likopen przez włączanie wywyłączanie pompy próżniowej. Odebrać likopen w kolbce i przenieść go do kolby miarowej na 25 ml, uzupełnić heksanem do kreski. Zmierzyć absorbancję fali przy dł. 471 nm, zawartość likopenu wyliczyć ze wzoru:

likopen (pg/g s.m.)=

E*25ml* 10000 3450* masa

E -ekstynkcja odczytana ze spektrofotometru m - masa próbki naniesiona na kolbę chromatograficzną (5 mg)