apoptoza006

watywności [237]. Prodomeny kaspaz inicjujących i związanych ze stanami zapalnymi są dłuższe (> 100 aminokwasów), zaś wykonawczych krótkie, zwykle nie przekraczające 30 aminokwasów [58, 196]. W dłuższych prodomenach występują odmienne motywy sekwencji aminokwaso-wej opisywane jako DED (ang. death cjjector domain) lub CARD (ang. caspase reeruitmeni domain) (rys. 23.1). Wspomniane motywy uczestniczą w interakcjach między prokaspazami i białkami adapto-rowymi apoptozy, a także odgrywają rolę w aktywacji prokaspaz. Proces aktywacji zymogenów m.in. przez autoproteolizę, związanie z cząsteczkami adaptorowymi, cięcie przez kaspazy czy inne proteazy prowadzi do powstania dojrzałych kaspaz, które są heterotetramerami [90, 249, 250]. Każdy heterodimer pochodzący z tej samej cząsteczki zymogenu tworzy domenę glo-bularną, której rdzeń stanowi sześć struktur p („pofałdowanej kartki"; 5 ułożonych równolegle i 1 antyrównolegie) otoczonych po jednej stronie przez dwie, a po drugiej przez trzy a-heliksowe zwoje [202, 237]. Z kolei dwa heterodimery asocjują ze sobą głównie poprzez oddziaływania pomiędzy podjednostkami mniejszymi.

Mechanizm aktywacji. Aktywacja kaspaz przebiega według dwóch odmiennych mechanizmów, tj. honioaktywacji i hetero-aktywacji [237]. Pierwszy z tych mechanizmów dotyczy aktywacji kaspaz inicjujących np. -8/-10, -9 poprzez autoproteolizę i tworzenia, ważnych dla przebiegu szlaku receptorowego i mitochondrialnego apoptozy, kompleksów DISC (ang. death inducing signa/ling complex) i tzw. apo-ptosomu. Podczas tych procesów dochodzi do oligomeryzacji cząsteczek kaspaz (por. 23.4.2 i 23.4.3). Utworzone kompleksy na wspomnianych szlakach ulegają molekularnym „przeorganizowaniom", w wyniku których autoproteoliza prokaspaz inicjujących prowadzi do tworzenia ich aktywnych heterotetramerów. Pełna aktywacja kaspaz przez oligomeryzację wzmaga ich aktywność [159], która przejawia się proteolizą kolejnych kaspaz (bądź kaskady kaspaz). Z kolei heteroaktywacja prowadzi do katalitycznego ataku kaspaz inicjujących (np. -8/-10, -9) bądź innych proteaz (np. gran-z.yrn B) na prokaspazy wykonawcze, przeprowadzając je w aktywne heterotetrame-ry. Cięcie proteolityczne przez inicjującą kaspazę-8, czy granzym B kaspaz wykonawczych, w pierwszej kolejności dotyczy ich regionu łącznikowego, co pozwala na stworzenie częściowo aktywnego pośredniego kompleksu, który następnie przekształca się w dojrzałą kaspazę. Łącznik między podjednostkami kaspaz wydaje się zapobiegać autoaktyw'acji tych enzymów. Natomiast w aktywacji prokaspaz wykonawczych przez kaspazę-9 istotnym wydarzeniem jest usunięcie prodomeny, a następnie dalsze przeorganizowanie w aktywną postać enzymu [237]. W fazie wykonawczej apoptozy prokaspaza-3 (32 000) jest rozszczepiona przez kaspazę-8 czy -9 do fragmentów 20 000/17 000 i 12 000, które formują następnie aktywne heterotetramery [ 181J.

Katalityczna aktywność kaspaz; substraty.

W aktywnych hctcrotctramcrach kaspaz zidentyfikowano 2 centra aktywne umieszczone w^; szczelinach tworzonych przez podjednostki a i /}, prawdopodobnie sprawujące funkcje katalityczne niezależnie [91]. W miejscach aktywnych Cys²⁸⁵ zbliża się do imidazolowego pierścienia His²³⁷ (np. w podjednostce a kaspazy-1) przyciągając proton cysteiny, co wzmaga właściwości nukleofilowe tego aminokwasu (rys. 23.2). Z kolei łańcuchy boczne Arg¹™ (podjednostka a) i Arg³⁴¹ (podjednostka P) uczestniczą w bezpośrednich oddziaływaniach z cząsteczką Asp substratu (tzw. miejsce PI), która jest ostatnią resztą czte-roaminokwasowej sekwencji (P4<-P1) rozpoznawanej przez enzym [32]. Najważniejsze funkcje w ataku proteolitycznym kaspaz odgrywa centralnie położona w penta-