CCF20121026005

II. Rozdział białek z zastosowaniem chromatografii

Chromatografia jest metodą rozdziału, w której składniki mieszaniny ulegają podziałowi między dwie fazy. Jedna z nich jest fazą nieruchomą (stacjonarną), druga fazą ruchomą.

Faza nieruchoma może być:

1)    ciało stałe (adsorbent, wymieniacz jonowy lub sito molekularne)

2)    ciecz na stałym nośniku (na bibule chromatograficznej, adsorbencie lub wymieniaczu jonowym)

3)    żel (będący przeważnie odpowiednio zmodyfikowanym polisacharydem).

Faza ruchoma jest najczęściej ciecz zwana solwentem.

Poszczególne składniki rozdzielanej mieszaniny nazywa się solutami. Faza nieruchoma nie zmienia swego położenia w trakcie rozdziału chromatograficznego, natomiast faza ruchoma (solwent) przemieszcza się względem fazy nieruchomej.

Do rozdziału chromatograficznego mieszaniny białek stosuje się jako solwent roztwory buforowe o stałej lub zmieniającej się wartości pH (gradient pH), a także o zmieniającej się sile jonowej (gradient siły jonowej). Używane są również różnego typu rozpuszczalniki, będące mieszaninami związków organicznych. Solwenty wykorzystuje się do rozpuszczania mieszaniny związków nakładanych na kolumnę, a następnie do selektywnego wymywania (=eluowania) składników zatrzymanych w fazie stacjonarnej.

Znanych jest wiele metod chromatograficznych i można je klasyfikować według różnych kryteriów. Ze względu na charakter oddziaływania na granicy fazy nieruchomej i ruchomej metody te dzieli się na:

-chromatografię adsorpcyjnąi podziałową (w tym chromatografię powinowactwa) -chromatografię jonowymienną -chromatografię żelową (sączenie molekularne)

Biorąc pod uwagę technikę wykonywania rozdziału wyróżnia się:

-chromatografię bibułową i cienkowarstwową -chromatografię kolumnową

Uwzględniając z kolei stan skupienia fazy ruchomej, rozróżnia się chromatografię:

-cieczową

-gazową

Zastosowanie sączenia molekularnego do oddzielenia mieszaniny białek od innych związków

Kryterium rozdziału w metodzie sączenia molekularnego są różnice w wielkości cząsteczek. Rozdział zachodzi na kolumnie wypełnionej ziarnami żelu dekstranowego (wielkocząsteczkowy polimer glukozy) o kontrolowanych wymiarach i porowatości. Technikę tę wykorzystuje się również do wyznaczania masy cząsteczkowej białek oraz odsalania.

Obserwacja rozdziału na sitach molekularnych jest szczególnie łatwa w przypadku oddzielenia dwóch substancji barwnych. Do tego celu można wykorzystać mieszaninę hemoglobiny i błękitu metylenowego. Rozdział tych związków obserwuje się bezpośrednio na bezbarwnym absorbencie. Hemoglobina jako związek, którego cząsteczki mają większe rozmiary niż błękit metylenowy, nie przedostaje się do wnętrza porów ziaren żelu. Wypływa ona wraz z wczesnymi porcjami solwentu (faza ruchoma), pojawiając się w wycieku z kolumny jako pierwsza. Z kolei cząsteczki błękitu metylenowego przedostają się do wnętrza porów ziaren żelu (faza stacjonarna), stąd do ich elucji potrzebna jest większa objętość solwentu.

27