DSCF6748

104

Podstawą rozdziału chromatograficznego jest fakt, że poszczególne składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają rozdziałowi między dwie niemieszające się fazy - fazę ruchomą (.nieruchomą układu chromatograficznego. Jeżeli fazą ruchomą jest ciecz zaś faza nieruchoma umieszczona jest w kolumnie, to mówimy o cieczowej chromatografii kolumnowej.

Kolumna wraz ze znajdującym się w niej wypełnieniem jest częścią chromatografu .cieczpwego, w której zachodzi właściwy proces chromatograficzny. Rozdzielone składniki analizowanej mieszaniny na wyjściu z kolumny są wykrywane przez detektor. Sygnał elektryczny z detektora po wzmocnieniu jest zapisywany w postaci piku chromatograficznego. W ten sposób otrzymany chromatogram może być interpretowany jakościowo i ilościowo.

Analiza jakościowa polegająca na identyfikacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom próbki odbywa się przede wszystkim za pomocą wielkości retencyjnych (czas, objętość). Porównuje się na przykład czas retencji piku identyfikowanej substancji (czas mierzony od momentu nastrzyknięcia próbki na kolumnę do chwi pojawienia się maksimum piku) z czasem retencji piku wzorca, chromatografowanych w tych samych warunkach. Ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wykorzystując fakt, że ilość tych składników jest proporcjonalna do powierzchni lub wysokości ich pików.

Odczynniki

Faza ruchoma: diwodorofosforan (V) potasu o stężeniu c(KH₂P0₄) = 0.04 mol/l: metanol (60 : 40 v/v).

Metanol, roztwór wodny o stężeniu 95%.

Metanol, roztwór wodny o stężeniu 20%.

Wodorotlenek sodu cz.d.a., roztwór o stężeniu c(NaOH) = 0.1 mol/l. Substancja wzorcowa - propylotiouracyl.

Preparat farmaceutyczny: PROPYLOTHIOURACYL 50 mg (Lederłe Laboratories Division).

Argon.

Aparatura i sprzęt laboratoryjny

Kolby miarowe pojemności 10 ml	8 szt.
Zlewki pojemności 30 ml	8 szt.
Zlewki pojemności 250 ml	1 szt.
pipeta pojemności 5 ml	1 szt.
Naczynka wagowe	4 szt.
Lejki małe	2 szt.
Łopatka	1 szt.
Sączki
Moździerz i tłuczek
Chromatograf cieczowy
Waga analityczna

Wykonanie ćwiczenia

'■ 1. Kondycjonowanie kolumny chromatograficznej iwwl.1. Około 50 ml 20% roztworu metanolu odgazować przepuszczając argon przez 15 minut.

y w aga:    odgazowywanie ma na celu usunięcie

pęcherzyków gazu, zakłócających detekcję wykrywanych składników oraz mogących uszkodzić kolumnę oraz zakłócić detekcję.

1.2.    Przez kolumnę przepuszczać wyżej wymieniony roztwór metanolu z szybkością 1 ml/min przez około 30 minut.

2.    Ustalanie lini podstawowej

2.1.200 ml fazy ruchomej (metanol: diwodorofosforan (V) potasu w stosunku objętościowym 40 : 60) odgazować przepuszczając argon przez około 15 minut.

2.2.    Przez kolumnę przepuszczać odtlenioną fazę ruchomą z szybkością przepływu 1 ml/min do momentu ustalenia się linii podstawowej w postaci odcinka prostoliniowego.

3.    Wykonanie krzywej wzorcowej.

3.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych.

Odważyć 0.05 g substancji czynnej - propylotiouracylu. Odważkę przenieść do kolbki miarowej pojemności 10 ml i uzupełnić do kreski wodorotlenkiem sodu o stężeniu c(NaOH) = 0.1 mol/l. Z tak pizygotowanego roztworu pobrać pipetą do kolbek miarowych pojemności 10 ml odpowiednio: 1, 2, 3 i 3.5 ml i uzupełnić wodorotlenkiem sodu o stężeniu c(NaOH) = 0.1 mol/l do objętości 5 ml, a następnie uzupełnić wodą do kreski. Tak przygotowane roztwory wzorcowe przelać do zlewek pojemności 30 ml. Za pomocą strzykawki zigląnastrzyknąć kolejno przygotowane roztwory na kolumnę.