CCF20130426005

Badania chemików-organików i biochemików doprowadziły do poznania budowy i właściwości bardzo wielu białek poprzez badania aminokwasów wchodzących w skład tych białek. Do metod obecnie rutynowych należy określanie składu aminokwasowego białek, tzn. rodzaju i proporcji aminokwasów tworzących łańcuchy polipeptydowe badanego białka oraz analiza struktury I-rzędowej, tzn. określanie pozycji, jaką zajmuje kolejno każdy aminokwas w łańcuchu polipeptydowym. Do celów takich badań rozwinięto szereg metod otrzymywania specyficznych pochodnych aminokwasów, wykorzystując zarówno reaktywność grupy aminowej jak i karboksylowej. Historycznie najstarsza jest metoda tworzenia żółto zabarwionych pochodnych dinitrobenzenowych w reakcji aminokwasów z l-fIuoro-2,4-dinitrobenzenem. Metoda ta służyła przy badaniach sekwencji aminokwasów w polipeptydach do określania aminokwasu N-końcowego (z wolną grupą aminową). Obecnie stosowane reakcje polegają na ogół na tworzeniu pochodnych aminokwasów wykazujących fluorescencję, przy czym długość fali światła wzbudzonego zależy od budowy łańcucha bocznego aminokwasu. Do otrzymywania fluoryzujących pochodnych służą m.in. kwas ftalowy i chlorek dansylu — chlorek 5-(N,N-dimetyioaminojnaftalenosuifonylu.

Do celów zautomatyzowanych analiz sekwencji aminokwasów w polipeptydach stosuje się najczęściej tioizocyjanian fenylu, pozwalający na otrzymywanie łatwych do identyfikacji fenylotiohydantoinowych pochodnych aminokwasów (PTH-aminokwasów), lub chlorek dabsy-lu czyli chlorek 4-N,N-dimetyloamino-azobenzeno-4-sulfonylu (rys.6.), reagujący z aminokwasami ilościowo i pozwalający dokładnie wyznaczać stężenia poszczególnych aminokwasów w badanych próbkach.    Rys. 6. Chlorek dabsylu

Do analiz chromatograficznych stosuje się obecnie bardzo precyzyjne i szybkie chromatografy cieczowe wysokociśnieniowa (HPLC), ale rozdział jakościowy można uzyskać nawet przy pomocy chromatografii bibułowej.

6. Chromatografia cienkowarstwowa dabsylowych pochodnych aminokwasów

Chromatografia cienkowarstwowa jest techniką chromatografii wykonywanej na nośniku umieszczonym w postaci cienkiej warstwy na płytkach lub foliach, które mogą być wykonane z tworzyw sztucznych, aluminium lub szkła. Nośnikami najczęściej stosowanymi są: żel krzemionkowy, tlenek glinu, mikrokrystaliczna celulozą sefadeks. Roztwory badanych mieszanin nanoszone są w postaci maleńkich plamek blisko dolnej krawędzi płytki wzdłuż tzw. „linii startu”. Po odparowaniu rozpuszczalniką płytki umieszcza się w komorze nasyconej parami układu rozwijającego i prowadzi chromatografię do chwili osiągnięcia przez czoło układu okolicy górnej krawędzi płytki („linia frontu”). Stosunek odległości przebytej od linii startu przez składnik mieszaniny do odległości przebytej przez rozpuszczalnik jest to tzw. współczynnik Rf (od ang. retardańon factor — współczynnik opóźnienia), któty w określonym układzie chromatograficznym jest wielkością charakterystyczną dla danego składnika analizowanej mieszaniny. Rozdział badanej próbki na poszczególne związki dokonuje się na zasadzie różnicy ich adsorpcji na nośniku (chromatografia absorpcyjna), różnicy rozpuszczalności w dwu fazach ciekłych: rozpuszczalniku i wodzie związanej w żelu (chromatografia podziałowa) lub też, w szczególnych przypadkach, różnicy ładunku (chromatografia jonowymienna). Najczęściej stosowdarte techniki są kombinacją wszystkich tych rodzajów chromatografii.

6