IMG64

60 / ROZDZIAŁ 4

AMINOKWASY / 51

taje ńę rozdział składników mieszaniny między fazy    gn i ciekłą    ruchomą. różniące

dę połarnołdą, z jaką faza ruchoma przesuwa lif V stommlm do fazy stacjom*rncf, Rozdział odbywa *tę n* podstawie odmiennej rozpuszczalności składników w fazach stacjonarnej i ruchomej.

Podziałowa TLC

W typową PTLC faza stacjonarna jest bar-PBiskładnUdem-^Ttozpuszczalnik stosowany do rozwijania zawiera zarówno polarne, jak i mato polarne składniki, np. wodę, cztero- lub pięciowęgjowy alkohol i słaby kwas czy zasadę, np. kwas octowy czy amoniak. Ody ro zwijacz przesuwa się nad nośnikiem, rozpuszczalnik zmienia skład, ponieważ bardziej polarne składniki wiążą się z polarnymi grupami —OH celulozy. Przesuwające się czoło rozpust* płatnika staje się więc stopniowo mniej polarne. Składniki mieszaniny o mniejszej polarnoicil przesuwają się dalej niż polarne składniki podo-l hnej wielkości. Na przykład kwas glutaminowy i lizyna przesuwają się wolniej, natomiast leucy-na i wahną wędrują razem z rozpuszczalnikiem. Podobne rozważaniu stosują się do chroma to* grafii bibułowej.

Ryc. 4

Law

Ryc. 4-10. HPLC w fazie odwróconej AQC pochodnych aminokwasów. (Reprodukowano za zgodą wg Cohen S.A., Michaud D.P.: Synthesis of a fluorescent derivatizing reagent, 6-aminoquino-fyl-/V-hydroxysuccinimidyl carbamate, and its ap-plication to the analysis of hydrolysate amino acids via high -performance liquid chromatography. Anat. Biochem. 1993; 211, 279).

i pochłaniające UV pochodne aminokwasów. Czułość tego drugiego rozwiązania (pre--column) pozwala analizować pikomolowe ilości materiału — na ogół 1—2 pg oczyszczonego białka czy 0,2 pg krótkiego peptydu (ryc. 4-10).

Podziałowa TLC w lazła odwróconej W wariancie metody PTLC, zwanym i PT IX.. w fazie odwróconej⁰, zarówno polar-ność faz, jak i szybkość składników próby są odwrócone w stoaunku do tych w typowej PT IX Ruch fazy utrzymuje jej polarność. Faza stacjonarna, zwykłe celuloza pokryta mcpolar jak olej silikonowy', czyni fazę mniej polarną, W p//cciwicńst wjc do typową FIX(polarne składniki wędrują z rozpust-czajnikiem, podczas gdy ruchliwość składników | mniejszej polarności jc»ł spowolniona.

Adoorpcyjna TLC

Zasada rozd/jalu w adtorpcyjncj TLC' je*l całkowicie odmienna. Rozdział ty technika polega na adsorpcji składników próby na prażonym żelu krzemionkowym, l ara ruchoma, zwykle jedno- luh dwuskładnikowa mieszanina roz-puszcze Iników organumych, cluujc zuadsorbo-wane składniki, współzawodnicząc o miejsce wiązania na żelu krzemionkowym Słabiej związane składniki usuwane w pierwszej kolej-nnóai,

Wyaokoeprawna chromatografia cłoczowa (HPLC)

W rozdziałach wykorzystujących klasyczną kolumnę chromatograficzną używa się kolumny szklanej wypełnionej ściśliwym złożem w warunkach, które wykluczają stosowanie wyso-kich ciśnieńj To wymusza górną granicę szybkości przepływu rozpuszczalnika, a zatem szybkość analizy. Wysokosprawna (wysokociśnieniowa) chromatografia cieczowa (HPLC) wykorzystuje oczyszczanie oparte na tych samych zasadach jak w klasycznej chromatografii kolumnowej. Kolumny ze stali nierdzewnej są wypełnione mniejszymi, bardziej jednorodnymi cząstkami nieściśliwego wymieniacza jonowego, sita | molekularnego lub złoża stosowanego w chro-§ matografii oddziaływań hydrofobowych. Sterowane ciśnienie od 5000 do 10 000 psi skraca czas potrzebny do rozdziału z kilku godzin do paru minut. W ten sposób zmniejsza dyfuzję boczną, funkcję czasu pracy kolumny i zapewnia lepszy rozdział. W analizie są możliwe dwa rozwiązania. Aminokwasy mogą wchodzić w reakcję z odczynnikiem, który ułatwia ich wykrycie i ilościową ocenę albo przed, albo po HPLC.

W rozwiązaniu wykorzystującym detekcję po rozdziale (post-column) powszechnie stosuje się ninhydrynę (ryc. 4*8), która powoduje powstanie purpurowego zabarwienia po połączeniu z aminokwasami. Jednakże ten sposób detekcji (post-column) jest zastępowany reakcją mieszaniny aminokwasów przed rozdziałem HPLC z odczynnikiem takim jak 6-aminochinoli* no-/V-hydroksybursztynoimidokarbaminian (ĄQCJ (ryc. 4-9), który tworzy fluorescencyjne

MM

Ninhydryna.

rr

Y

o

Ryc. 4 0. 6 Amłnochinollno-/V hydroksyburszly nolmidokarbaminlan (AOC).

Elektroforeza wysokonapięciowa (HVE)

Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-•voltage electrophoresis; skrót — HVE) rozdzielająca aminokwasy, poiipeptydy i inne am-folity (cząsteczki, których ładunek całkowity zależy od pH otaczającego środowiska) w polu prądu stałego ma wiele zastosowań w biochemii. W analizie aminokwasów najczęściej używanymi nośnikami są arkusze bibuły albo cienkowarstwowe płytki powleczone sproszkowaną celulozą. W rozdziałach wielkocząsteczkowych polipeptydów i białek używa się usiecio-wanego żelu poliakryloamidowego. W analizie oligomerów nukleotydowych wykorzystuje się głównie dwa złoża ugarozę i żel poliak-ryloamidowy.

Rozdział amfolitów zależy od ich ładunku elektrycznego i masy cząsteczkowej. W przypadku cząsteczek obdarzonych jednakowym ładunkiem elektrycznym szybciej będą wędrować cząsteczki o mniejszej masie. Ładunek elektryczny jest jednak ważniejszym czynnikiem w określeniu stopnia osiągniętego rozdziału. Elektroforeza HVE znajduje zastosowanie w analizie aminokwasów, małocząsteczkowych polipeptydów, nukleotydów i fosfosacharydów. Próbki nanosi się na nośnik zwilżony buforem o odpowiednim pH i łączy się ten nośnik ze zbiornikami buforu za pomocą bibułowych łączników. Po podłączeniu prądu cząsteczki obdarzone ładunkiem dodatnim wędrują w roztworze o wybranym pH w kierunku katody, a cząsteczki z ładunkiem ujemnym — w kierunku anody. W celu zidentyfikowania rozdzielonej próby elektroforegram wybarwia się odczynnikiem ninhydrynowym (aminokwasy, pepty-dy) lub bromkiem etydyny i ogląda w świetle lampy UV (oligomery nukleotydowe) itd. Wybór pH zależy od wartości pK grup jonizowanych cząsteczek w mieszaninie.

GRUPY FUNKCYJNE AMINOKWASÓW WARUNKUJĄ ICH REAKCJE CHEMICZNE

Reakcje chemiczne, w których uczestniczą aminokwasy, są warunkowane przez obecne w nich grupy funkcyjne, tj. grupę ot-aminową i a-karboksylową oraz grupy funkcyjne ich rodników (R). Każda z grup funkcyjnych może brać udział we wszystkich charakterystycznych dla niej reakcjach chemicznych. Obejmują one w przypadku grupy karboksylowej dysocjację i tworzenie estrów, amidów i bezwodników kwasowych. Dodatkowe reakcje obejmują jonizację, acylację i estryfikację grup aminowych, utlenianie i aJkilację grup —SH, estryfikację grup —OH itd.

NAJWAŻNIEJSZĄ REAKCJĄ AMINOKWASÓW JEST TWORZENIE WIĄZANIA PEPTYDOWEGO

Tworzeniu wiązania peptydowego towarzyszy z reguły odłączenie ł mola wody, powstającego z grupy ot-uminowej jednego aminokwasu i grupy a-kar boksytowej drugiego aminokwasu (ryc. 4-11). Reakcja ta nie przebiega jednak tak.