IMG63 (3)

48 / ROZDZIAŁ 4

Tabela 4*3. Podział L-a-aminokwasów występujących w białkach na podstawie względnej polar-fibicf ich grup R. W grupie niepolarnej jest mała różnica w ładunku elektrycznym między regionami łub nie ma jej wcale, natomiast w grupie polarnej różnica ta jest dość duża

Aminokwasy niapolarne (hydrofobowe)	Aminokwasy polarna (hydrofitowe)
Alanina	Arginina
Izoleucyna	Asparagina
Leucyna	Kwas asparaginowy
Metionina	Cysteina
Fenyloalanina	Kwas glutaminowy
Prolina	Glutamina
Tryptofan	Glicyna
Walina	Histydyna
	Lizyna
	Seryna
	Treonina
	Tyrozyna

bursztynowy uczestniczą w biosyntezie mocznika, tyrozyna w powstawaniu hormonów tarczycy i glutaminian w biosyntezie neuroprze-kaźników. W stanie naturalnym występuje ponad 20 D-aminokwasów. Należą do nich D-alanina i kwas D-glutaminowy ścian komórkowych niektórych bakterii oraz różne D-ami-nokwasy wchodzące w skład antybiotyków.

Naładowane grupy R aminokwasów zasadowych odgrywają główną rolę w utrzymywaniu swoistej konformacji białka przez tworzenie wiązań typu soli. ^Przerwanie i odtworzenie wiązań typu soli towarzyszy utlenowaniu i od-tlenowaniu hemoglobiny (p. rozdz. 7). Ponadto aminokwasy z dodatnio lub ujemnie naładowanymi grupami R uczestniczą w układach „przekazywania ładunku” (ang. „charge relay”) na znaczne odległości podczas katalizy enzymatycznej | Histydy na ponadto pełni wyjątkową i ważną funkcję w katalizie enzymatycznej, gdyż wartość pK jej formy protonowej układu imida-zolowego dopuszcza w pH 7,0 działanie jej jako katalizatora zasadowego liib kwasowego.

Pierwszorzędowa grupa alkoholowa seryny i pierwszorzędowa grupa tioalkoholowa (—SH) cysteiny są doskonałymi czynnikami nukleofi-lowymi, których funkcja jest ważna dla katalizy. Z kolei drugorzędowa grupa alkoholowa treoniny jest dobrym czynnikiem nukleofilo-wym, aczkolwiek nie jest znany jej udział w katalizie. Dodatkowo, grupa —OH seryny, tyrozyny i treoniny także odgrywa rolę w regulacji aktywności niektórych enzymów, których aktywność katalityczna zależy od stanu ufosfory-lowania swoistych hydroksylowanych reszt aminoacylowych.

Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego (tj Jsą one bezbarwne) i, z wyjątkiem aminokwasów aromatycznych: tryptofanu, tyrozyny, fenyloalaniny i histydyny, nie absorbują światła nadfioletowego o długości powyżej 240 nm.

Ryc. 4-6. Widma absorpcyjne tryptofanu, tyrozyny i fenyloalaniny.

GRUPY R PRZY WĘGLU a OKREŚLAJĄ WŁAŚCIWOŚCI POSZCZEGÓLNYCH AMINOKWASÓW

Glicyna, najmniejszy aminokwas, może „dopasować się” łatwo w obszary trójwymiarowej struktury białek, niedostępne dla innych aminokwasów i występuje w obszarach, w których łańcuchy peptydowe ulegają silnemu zwinięciu;

Alifatyczne grupy R alaniny, walmy, leucy-ny i izolencyny oraz aromatyczne grupy R feny-loalaniny, tyrozyny i tryptofanu są hydrofobowe 1 ta właściwość ma ważne znaczenie w uporządkowaniu cząsteczek wody w białkach, w bezpośrednim sąsiedztwie tych grup. Te aminokwasy są charakterystyczne przede wszystkim dla wnętrza łańcuchów białek cytozolo-rych

Niektóre aminokwasy, szczególnie trypto-fan, absorbują światło nadfioletowe o długości fali od 250 do 290 nm ||||j 4-6). Stąd, względnie rzadki w większości białek, tryptofan warunkuje zdolność ich absorpcji w regionie 280 nm.

różne techniki rozdziału aminokwasów

Techniki chromatograficzne omawiane po-oiżej znajdują zastosowanie w rozdzielaniu materiałów o znacznej różnorodności, nie ograniczają się więc tylko do aminokwasów i ich pochodnych.

Chromatografia bibułowa i zautomatyzowana chromatografia jonowymienna w dużym stopniu są wypierane przez nowsze i lepsze chromatograficzne techniki analityczne, jednak zasady, na których się opierają, są ogólne i wciąż znajdują zastosowanie w badaniach medycznych.

Chromatografia

We wszystkich rodzajach chromatografii cząsteczki rozdzielają się między fazą stacjonar-oąa ruchomą.

KÓzdział zależy od względnej tendencji cząsteczek mieszaniny do ich silniejszego wiązania aę z jedną z tych faz.

Chromatografia bibułowa

Wc&romatografii bibułowej kroplę roztworu zawierającego jeden lub więcej aminokwasów nanosi się na pasek bibuły w odległości 5 cm od jego końca. Następnie pasek umieszcza się 1 szczelnym naczyniu, w którym koniec paska styka się z rozpuszczalnikiem; jest nim zwykle nasycony wodą niskocząsteczkowy alkohol zawierający kwas lub zasadę.

Po przepływie rozpuszczalnika wzdłuż paska bibuły suszy się go i wybarwia roztworem ninhydryny w acetonie, a po krótkotrwałym wysuszeniu pozycje aminokwasów uwidaczniają się na nim w postaci purpurowych plam (ryc. 4-7). Względna polarność warunkuje ruchliwość chromatograficzną.

Aminokwasy z długimi niepolarnymi grupami | (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met) wędrują dalej od tych z krótszymi niepolarnymi (Pro, Ala), czy z polarnymi grupami R (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lys, Cys; ryc. 4-7). W grupie

Kierunek

wędrówki

rozpuszczalnika

Lys

Asp

Gly

Thr

Pro

Val

Trp

Phe

Leu

Ryc. 4-7. Identyfikacja aminokwasów występujących w białkach. Po rozdziale mieszaniny aminokwasów techniką chromatografii bibułowej zstępującej w układzie /i-butanol-kwas octowy-woda plamy aminokwasów wywołano za pomocą nin-•hydryny.

cząsteczek niepolamych (Gly, Ala, Val, Leu) zwiększeniu długości ich niepolarnej grupy R towarzyszy ich zwiększona ruchliwość.

Stosunek odległości przebytej przez aminokwas do odległości przebytej przez czoło rozpuszczalnika, mierzonych od miejsca naniesienia mieszaniny aminokwasów, stanowi wartość R_r (względna ruchliwość).

Wartości Hp dla danego aminokwasu zmieniają się w zależności od warunków doświadczalnych, np. od stosowanego rozpuszczalnika. Zaleca się rozdział chromatograficzny aminokwasów wzorcowych równolegle z mieszaniną nieznanych aminokwasów i wtedy ich ruchliwość może być wyrażona względem tej, którą osiąga wzorzec (np. raczej jako Rai* niż jako Rr): wartość ta różni się mniej niż Rr z kolejnych doświadczeń.

Chromatografia cienkowarstwowa

Wyróżnia się dwa odrębne typy chromatografii cienkowarstwowej (thin-łayer chromato-graphy — TLC): podziałową TLC (partition TLC — PTLC) i adsorpcyjną TLC (adsorption TLC — ATLC). W podziałowej TLC wykorzys-

ł Biochemia Harpcra