Klonowanie genów

Klonowanie genów

Promotor    Gen struktury

11 i

Donorowy DNA (gen struktury, np ludzki gen) może być wyizolowany z biblioteki genomowej wytworzonej na matrycowym RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy.

Ludzki promotor zostaje zastąpiony promotorem bakteryjnym. To zapewnia dużą szybkość transkrypcji i syntezy ostatecznego produktu genu w systemie bakteryjnym.

Lepkie końcezostają dodane do donorowego DNA. Są to krótkie sekwencje nukleotydowe o dł. 3-6 pz, które dołączą się do komplementarnych sekwencji w plazmidzie nośnikowym. Można je uzyskać przez odpowiednie cięcie restryktaz (enzymów restrykcyjnych, które są swoistymi endonukleazami przecinającymi nić w odpowiednim miejscu).

Nośnikowy DNA, zwykle plazmid bakteryjny, został otwarty w obszarze sekwencji komplementarnej do lepkich końców donorowego DNA. Nośnikowy plazmid zawiera także np gen odporności na antybiotyk mające podstawowe znaczenie dla późniejszych procesów selekcyjnych.

Donorowy DNA zostaje dołączony do nośnikowego za pomocą ligaz, enzymów tworzących wiązania DNA (komplementarne lepkie końce nakładają się na siebie)

Powstaje w efekcie zrekombinowany DNA niosący ludzki gen wewnątrz plazmidu, który jest teraz zrekombinowanym plazmidem.

Komórka bakteryjna, najczęściej niepatogenna, zostaje potraktowana jonami wapnia, które czynią ją przepuszczalną. Przyjmuje ona plazmid, ulega transformacji. Mimo że ilość plazmidów znacznie przewyższa ilość bakterii to transformacji w ten sposób ulegnie ok. 1% komórek bakteryjnych. Wszystkie bakterie poddaje się selekcji i wyselekcjonowane komórki są powielane (klonowane) i inkubowane w odpowiednich warunkach.