Schowek02

siewana jest populacje po iiiutsrer.izac ji, wprowadzony jest w/w antybiotyk w stężeniu 100 pg/mł.

Mutanty A. niger selekcjonowane są pod kątem zwiększenia ich aktywności aroyłazotwórczej.

Wybór najaktywniejszych mutantów A. niger polega na pomiarze stref upłynnienia skrobi wokół kolonii grzybni y/yrosłej ze spor, które przeżyły naświetlanie*

3* Materiały, odczynniki, sprzęt

-    kultura szczepu Baciłlus sp.

-    'zawiesina spor Aspergillus niger

-    podłoże stałe ”W” do hodowli płytkowej Baciłlus sp. o składzie skrobia rozpuszczalna - 10 g/l, Bactotryptone - 5 g/l, bulion

^ mięsny - 3 g/l, hydrolizat kazeiny - 3 g/l, NaCl - 2,5 g/l, agar - 3%

-    podłoże stałe "W" z dodatkiem streptomycyny w stężeniu 100 yg/ml

-    podłoże stałe do hodowli płytkowej A. niger o składzie: skrobia rozpuszczalna - 1,596, agar - 3%, Na^HPO^ - 0,1%,

XH₂P0^. - 0,1%, MgS0₄ - 0,05%

-    sterylne roztwory 0,1 M MgSO^ (15 kolb po 99 ml)

-    roztwór J2 w KJ

-    płytki Petri*ego o b 5 cm - 10 szt.

-    płytki Petri'ego o i 10 cm - 35 szt.

-    sterylne pipety 0,5; 1; 2; 5; 10 ml

-    ‘wirówka

-    lampy UV - 2 szt.

-    mieszadła magnetyczna - 2 szt.

-    podświetlacz płytek

mikroskop

okulary

- maseczki.

A. Wykonanie ćwiczenia

4,1. Mutagenizacja bakterii rodzaju Becillus

a)    Komórki Bacillus sp. z 12-to godzinnej hodowli wstrząsanej odwirować w sterylnych kuwetach w ciągu 10 min. przy szybkości obrotów 4 000 min”¹. Osad komórek zawiesić w 100 ml roztworu 0,1 M MgSO_v

b)    Otrzymaną zawiesinę komórek rozcieńczyć 1000^krotnie

(1 ml -> 100 ml,' 1 rai -> 100 ml) korzystając z przygotowanych

5    6 /

, roztworow MgSO^, by uzyskać stężenie komorek 10-10 /ml.

c)    Trzy 5-cio mililitrowe porcje zawiesiny komórek wylać na

płytki Petri'ego o średnicy 5 cm, ustawić je w odległości 12 cm od promiennika i naświetlać kolejno promieniami UV w ciągu 9, 12 i 15 min. _L    ***)

d)    W celu oznaczenia miana wyjściowej zawiesiny komórek (punkt b)

rozcieńczyć ją 10000C()razy (1 ml    1 oćT"ral7'~'l*ml    100 ml,

1 ml 100 ml) i wysiać powierzchni owo-w ilości 0,5 ml na cztery płytki Petri*ego z podłożem W.

e)    Dla oznaczenia przeżywaIności komórek wysiać 0,2 mililitrowe porcje zawiesin po naświetleniu z podłożem V/ (po trzy płytki

’ dla każdego z czasów naświetlania).

f)    W celu określenia częstości ujawniania się mutantów streptomycyn! o opornych 0,5 ml próby zawiesin po mutagenizacji wysiać na płytki z podłożem W zawierającym dodatek streptomycyny w stężeniu 100 /ag/ml (po 3 płytki dla każdego z czasów naświetlania.

g)    Wysiane płytki inkubować w ciągu 2 dni w temp. 39°C.