Untitled 7

Sekwencje o zróżnicowanej liczbie tandemowych powtórzeń (VNTR)

Oprócz loci o unikatowej sekwencji, techniką RFLP można również idep.tyfikowaff wiele loci zawierających sekwencje o zróżnicowanej liczbie pptnórzeń domowych (VNTR). Powtarzalne sekwencje z loci VNTR jthogą być dhigjl (powyżej 100 pz), co cechuje makrosatelity, średnie (6- lófcf pz), odpowiadają minisatelitom lub krótkie (l-yspz), jak w przypadku uńkrosatclitów. Do analil roślinnych markerów VNTR wylmreystuje się sondy długości 300-600 pz, majffl sekwencje złożone z samych powtórzeń jednego rodzaju. Autoradiogramy VP zawierające dużą lk bę poliinorficziiych prążków, stanowią tzw. fingerprintuj DNA lub „odcisk palca” odmian i ceRnypfi materiałów hodowlanych, któf umożliwia ich identyfikację.

Markery RLGS

Skanowanie genomu markerami restrykcyjnymi^LGS) polega na dwukięr kowej elektroforezie fragmentów restrykcyjnych DNA i autoradiografii. Ęjl

troforezie w żelu agarozowym (1. kierunek) poddaje sic DNA trawiony dwf enzymami i znakowany radioaktywnie. Rozdzielone w żeliNfragmenty trawi-l situ trzecim enzymem restrykcyjnym i rozdziela w żelu poi i aktynami do wy m(l w kierunku prostopadłym do pierwotnego. Autoradiogramy, othtymywane'’flf ekspozycję wysuszanego żelu PAA z filmem rentgenowskim, zawierają ty&y plamek, reprezentujących fragmenty różnej długości. Metoda ta jest bardz do identynka^ył^różnic genetycznych między odmianami roślin uprawnych'

8.2.1.3. Markery uzyskiwane w metodzie PCR

Markery generowane uzyskiwane w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) tv liczną grupę, najczęściej obecnie wykorzystywanych markerów molekularni o szerokim spektmm zastosowań w diagnostyce genetycznej roślin.

Miejsca znaczone sekwencyjnie (STS)

Miejsca znaczone sekwencyjnie (STS) są markerami szczególnie przydai do identyfikacji chromosomów lub ich regionów w eksperymentach polegaj na introdukcji obcego DNA do genomu biorcy. Znajdują one również zastoso do wprowadzeniu klonów biblioteki DNA i w mapowaniu fizycznym. Klas marker STS jest fragmentem długości 200-300 pz otrzymywanym metodą z użyciem specyficznych starterów. Startery są projektowane na podstawie znajpj sekwencji całego fragmentu. Zapewniają cne wysoką specyficzność amp] potwierdzoną jednoprążkowym obrazem rozdziału produktów reakcji PCR, w matrycą był genomowy DNA. Obecność markera STS w dwóch klonach biblio! genomowej oznacza, że zawierają one sekwencje częściowo się pokrywaj Markery STS mogą więc służ;, t do uporządkowania klonów biblioteki Dlj w kontigi, czyli ciągi częściowo zachodzących na siebie sekwencji. Szczegół

przypadkiem markerów STS są specyficzne znaczniki ekspresji (EST). Reprezentują one znaną, unikatową sekwencję klonu cDNA, amplifikowaną dzięki starannie dobranym sekwencjom starterów. Posługiwanie się markerami EST daje pewność identyfikowania sekwencji kodującej jednego genu. Aby marker EST mógł spełniać to zadanie wobec matrycy stanowiącej genomowy DNA, miejsca hybrydyzacji starterów powinny znajdować się w obrębie eksonu.

Klasyczne markery STS wykazują na ogół niski stopień polimorfizmu, nie pozwalając na wykrycie różnic między sekwencjami allelicznynr ze względu na brak zróżnicowania długości amplifikowanych fragmentów. Pewną szansę na detekcję form allelicznych daje rozdział produktów PCR metodami DGGE, SSCP lub ich nawienie enzymem restrykcyjnym (metoda PCR-RFLP). Sekwencje przerywników - rozdzielających geny rRNA oraz sekwencje między genami tRNA są wykorzystywane w badaniach filogenetycznych ze względu na polimorfizm ich długości, obserwowana często tylko w relacjach międzygatunkowych. Polimorfizm ten jest wykrywany ^markerami STS, z użyciem starterów komplementarnych do znanych i konserwatywnych sekwencji genów kodujących rRNA lub tRNA.

Proste sekwencje powtarzalne (SSR)

Genomy roślin wyższych charakteryzuje obecność licznych sekwencji powtórzeń tandemowych, wśród których szczególnie przydatne w projektach mapowania jenomów są mikrosatelity, składające się z wielokrotnie powtórzonych krótkich 1-5 pz) sekwencji typu (AT)„ (A)„(T)_n, (AG)„(CT)_n, (GAA)„, (GACA)_n itp. Mikrosatelity rozlokowane są równomiernie w dużej liczbie na wszystkich ihromosomach, wykazując silny polimorfizm pod względem dhigości, warunkowany różną liczbą powtórzeń sekwencji podstawowej. Każdy odcinek mikro-śatelitarny jest oflankowany unikatowymi sekwencjami, które można wykorzystać do projektowania specyficznych starterów. Amplifikowane sekwencje mikrosatclitarne tworzą grupę markerów określaną jako proste sekwencje wtarzalne (SSR), krótkie tandemowe powtórzenia (STR) lub STS (rys. 8.2.2). aza wstępna opracowania markerów SSR zakłada przeszukiwanie biblioteki omowej DNA z użyciem sond zawierających sekwencję mikrosatelitamą. Po

5*

FŻE3S3E3SS2

sekwencja L unikatowa flankująca DNA mikrosatelitamy

CACACA(CA) CACAC GTGTGT(GT) GTGTGT

■*--sekwencja-».

mikrosatelitama

1

5'

sekwencja P unikatowa flankująca DNA mikrosatelitamy

PCR z użyciem starterów 20-24-nukleotydowych, komplementarnych do sekwencji flankujących

^CACACA(CA).CAęACĄl

GTGTGT(GT) GTGTGT i

Rys. 8.2.2. Istota-metody otrzymywania markerów SSR