Untitled 3

Markety DNA o istotnym znaczeniu poddawane są sekwencjonowaniu. Obecnie najczęściej stosowaną jest metoda „dideoksy” Sangera, czyli metoda kontrolowanego przerywania dideoksynukleotydem reakcji syntezy DNA. Do sekwencjonowania wymagane jest jednoniciowe DNA, wysoce oczyszczone i jednorodne. Polimeraza kopiuje matrycę rozpoczynając syntezę od oligonukleotydowego startera łączącego się komplementarnie z początkiem matrycy. Reakcję prowadzi się równolegle w czterech probówkach. Do każdej probówki oprócz dużej ilości czterech nukleotydów: adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy, które są komplementarnie włączane do powstającej nici, dodaje się niewielką ilość jednego z nukleotydów w postaci dideoksy. Zwykły nukleotyd ma grupę 3’OH, do której przyłączany jest kolejny nukleotyd. Postać dideoksy w niejsce grupy 3’OH ma sam atom wodoru, co uniemożliwia przyłączenie kolejnego nukleotydu. Dlatego w probówce zawierającej np. ddA, synteza łańcucha DNA będzie przerywana po wstawieniu ddA, co doprowadzi do powstania fragmentów DNA o różnych długościach, zakończonych zawsze ddA. Ponieważ ddA występuje w mieszaninie reakcyjnej w niewielkiej Rości, więc będzie losowo przyłączane niekiedy na początkowych etapach syntezy nici, a niekiedy synteza dojdzie niemal do końca. W każdej z czterech probówek powitanie mieszanina fragmentów' różnej długości, których synteza została przerwana na jednym z czterech nukleotydów. Jeśli teraz produkty reakcji podda się elektroforezie na żelu poliakrylamidowym w czterech równoległych ścieżkach, to powstała drabinka fragmentów pozwoli na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej. Sekwencję nici odczytuje się na podstawie znajomości końcowej zasady w kolejno coraz dłuższych fragmentach.

Do sekwencjonowania DNA na dużą skalę wykorzystywane są urządzenia półautomatyczne kontrolowane komputerowo. Reakcję sekwencjonowania przeprowadza się w jednej mieszaninie zawierającej cztery dideoksynukleotydy znakowane różnymi barwnikami. Sekwencję DNA odczytuje się na podstawie kolejności migrujących w żelu poliakrylamidowym fragmentów. Laser wzbudza dołączony barwnik, a system odczytuje końcow ą zasadę na podstawie długości fali errmowanej fluorescencji.

Dane o sekwencjach DNA różnych organizmów są gromadzone i udostępniane przez internetowe bazy danych