11

Enzymy 173

Enzymy 173

metodzie, równowaga ■a redukcją NAD⁺ do

-.26) można śledzić k • anej dinukleotydu 2'rie formy wykazują

cienia purynowego r. _ dodatkowe pasmo i..snia pirydynowego luktury aromatycznej

-Adenina

EH)

mr+ego

Szybkość reakcji powstawania aldehydu octowego i NADH można mierzyć poprzez pomiar przyrostu absorbancji przy 340 nm. Miarą szybkości reakcji są zmiany wartości A340 w jednostce czasu.

Metoda pomiaru zmian A340 w czasie reakcji katalizowanych przez dehydrogenazy, których koenzymem jest NAD^T lub NADP⁺, zwana jest optycznym testem Warburga. Jest to metoda szeroko stosowana do oznaczania aktywności wielu dehydrogenaz oraz enzymów katalizujących reakcje sprzężone z dehydrogenazami, gdzie w końcowym etapie także zachodzi redukcja nukleotydów pirydynowych.

Postępowanie

1. Przygotować mieszaninę reakcyjną - zmieszać: 1,45 ml 0,1 M buforu Tris-HCl o pH 8,8, 50 jil 5 mM NAD⁺ i 5-10 pl preparatu dehydrogenazy.

2.    /ZZffżff/Zzmierzyc^X₃4₀ (w razie potrzeby poczekać na ustabilizowanie wartości A₃₄₀).

3.    Reakcję zapoczątkować przez dodanie 10 pl etanolu i natychmiast rozpocząć pomiary A340 Wartości absorbancji odczytywać co 30 sekund.

4.    Przeprowadzić pomiary dla odpowiednich prób kontrolnych: [E⁺S~] i [E~S⁺],

5.    Na podstawie przyrostu A₃₄o/min oznaczyć aktywność preparatu enzymu w J/ml. Molowy współczynnik absorpcji dla NADH wynosi e₃₄₀ = 6 220 M^cnT¹.

Materiały i odczynniki

preparat dehydrogenazy alkoholowej uzyskany w doświadczeniu 4.10.4.1.

-    0,1 M bufor Tris-HCl, pH 8,8

-    5 mM NAD⁺ etanol (cz.d.a)

4.10.5. Katalaza

Zasada metody

Katalaza (EC 1.11.1.6) jest enzymem obecnym w peroksysomach prawie wszystkich morek eukariotycznych. W dużej ilości występuje w krwinkach czerwonych, komórkach s _:roby, a w mniejszej w komórkach roślinnych (np. ziemniak). Enzym jest hemoproteiną mdowaną z 4 podjednostek, z których każda zawiera w centrum aktywnym ugrupowanie

•    .-mowę. Jej funkcja sprowadza się do detoksykacji powstającego w komórkach nadlenku

•    ćoru z wytworzeniem wody i tlenu cząsteczkowego:

H₂0₂ + H₂0₂ o 2H₂0 + 0₂

tępowanie

W trzech probówkach umieścić niewielkie ilości (około 0,5 g) utartych ziemniaków : dodać 0,5 ml wody destylowanej.

Zawartość jednej z probówek zagotować we wrzącej łaźni i ostudzić, drugą umieścić w zamrażarce, a trzecią pozostawić w temperaturze pokojowej. Wszystkie próby inkubować w podanych warunkach przez 10 minut.

Do każdej probówki dodać 2 ml 3% wody utlenionej. Wydzielające się pęcherzyki tlenu świadczą o zachodzącej reakcji enzymatycznej.

Porównać wyniki otrzymane w poszczególnych próbach.