SCAN0458

Ćwiczenie 3

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMÓW na przykładzie pepsyny

Zadania kolokwialne:

1.    Podział enzymów

2.    Budowa enzymów

3.    Jednostki aktywności enzymów- od czego zależy aktywność enzymów

4.    Inhibitory reakcji enzymatycznych

5.    Regulacja reakcji enzymatycznych

6.    Metoda Lowry’ego

7.    Metoda Ansona

Cel: oznaczenie stężenia peptydów będących produktami reakcji proteolizy metodą Lowry’ego. Wykreślenie krzywej kalibracyjnej w układzie absorbancji od ilości białka (albuminy). Określenie czystości preparatu pepsyny.

Ćw. 1 Oznaczanie aktywności pepsyny wobec hemoglobiny metodą Ansona

Wykonanie

Część 1.

Hydroliza

Do czterech probówek szklanych w trzech powtórzeniach dodać kolejno 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml roztworu pepsyny a następnie po 1 ml 5 % roztworu hemoglobiny i dopełnić do 5 ml buforem o pH 2,2. Próby inkubować przez 30 min w 37 °C. Równolegle inkubować trzy próby kontrolne zawierające tylko roztwór pepsyny (0,5 ml) oraz bufor w takich samych ilościach jak dla prób badanych. Po inkubacji do wszystkich prób dodać po 5 ml 20 % roztworu TCA, a do prób kontrolnych ponadto 1 ml roztworu hemoglobiny. Próby przetrzymać w temp pokojowej przez 5 min mieszając a następnie przesączyć przez bibułę do kolbek stożkowych (15 kolbek małych).

Oznaczenie produktów hydrolizy

Do 0.5 ml klarownego przesączu (prób badanych i kontrolnych) dodać 2 ml wody destylowanej a następnie 5 ml 0,5 M roztworu NaOH i 0,5 ml rozcieńczonego (1 : 1,5) odczynnika Folina-Ciocalteu. Natychmiast dokładnie wymieszać i po 10 min odczytać absorbancję przy długości fali 720 nm wobec próby odniesienia przygotowanej w analogiczny sposób jak próby badane zawierające jednakże zamiast ekstraktu 0,5 ml 10 % TCA.

Część 2.

Przygotowanie krzywej wzorcowej tyrozyny

Do probówek dodać kolejno 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml wzorcowego roztworu tyrozyny co odpowiada kolejno 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 pmol tyrozyny. Uzupełnić partię do objętości 0,5 ml 0,2 N roztworem HC1. Równocześnie przygotować próbę odniesienia. Dalej postępować jak w przypadku oznaczania produktów hydrolizy. Wykreślić krzywą kalibracyjna w układzie absorbancji od ilości tyrozyny (oś x - stężenie tyrozyny w ml/pmol, oś y - absorbancja).