274845134

Ćwiczenie 2

Wpływ rozpuszczalników organicznych na stabilność enzymów na przykładzie dehydrogenazy alkoholowej

Zamiana środowiska działania enzymów ze środowiska wodnego na środowisko organiczne ma szczególne zastosowanie w biotechnologii, np. wtedy gdy substrat(y) łatwiej rozpuszczają) się w roztworach o niższej polamości niż woda. W środowisku organicznym można też przeprowadzić reakcje syntez przy użyciu hydrolaz, co praktycznie jest niemożliwe w środowisku wodnym. Przykładem takich syntez jest produkcja paliwa „biodiesel” z zastosowaniem lipaz katalizujących reakcję transestryfikacji kwasów tłuszczowych pochodzących z olejów roślinnych w obecności metanolu lub etanolu. Reakcja ta w środowisku wodnym nie zachodzi z uwagi na rozpuszczalność substratu oraz na powstający produkt reakcji - wodę, która będąc jednocześnie rozpuszczalnikiem, przesuwa równowagę reakcji w kierunku hydrolizy. Do kolejnych zalet środowiska organicznego można zaliczyć często zwiększoną termostabilność enzymów oraz mniejsze niż w roztworach wodnych ryzyko zakażenia mikroorganizmami. Co więcej, reakcje wymagające udziału substratów higroskopijnych, takich jak np. bezwodniki kwasowe zachodzą z większą wydajnością w środowisku organicznym. Ponadto modyfikacje polamości rozpuszczalnika wykorzystuje się czasem w celu kontroli stereospecyficzności enzymów.

Szereg enzymów wykazuje zwiększoną termostabilność w roztworach organicznych. Na przykład lipaza trzustkowa lub lizozym zachowują stabilność w temperaturze 100°C przez wiele godzin, podczas gdy tak znaczna trwałość enzymów nie jest możliwa w środowisku wodnym nawet po ich różnego rodzaju modyfikacjach (np. immobilizacji). Zwiększona termostabilność wynika między innymi z tego, że większość procesów prowadzących do nieodwracalnej inaktywacji białek, jak np. deamidacja, hydroliza wiązań peptydowych czy rozszczepianie reszt cystyny wymaga udziału wody. Interesujące jest, że optymalna temperatura działania mitochondrialnej ATPazy w kierunku hydrolizy ATP jest taka sama (około 58°C) zarówno w wodzie, jak też roztworze o jej małej zawartości. Natomiast stabilność tego enzymu jest znacznie większa w środowisku mniej polarnym.

Celem ćwiczenia jest zbadanie aktywności dehydrogenazy alkoholowej (EC 1.1.1.1) inkubowanej przez dwie godziny w środowisku wodnym lub organicznym w zakresie temperatur od 25 do 75°C. Dehydrogenaza alkoholowa katalizuje reakcje utlenienia alkoholu do aldehydu z jednoczesną redukcją NAD⁺ do NADH.

etanol + NAD⁺ aldehyd octowy + NADH

Zmiany stężenia NADH w czasie trwania reakcji można oznaczyć, wykorzystując jego zdolność absorbancji promieniowania elektromagnetycznego o długości fali 340 nm.

Wykonanie

Materiały i odczynniki

1.    50 mM bufor fosforanowy o pH 7,8 (30 ml)

2.    Toluen (200 pi)

3.    Dodekan (można zamiast dodekanu użyć oktanu) (200 pl)

4.    Dehydrogenaza alkoholowa (liofilizowana)

5.    100 mM wodny roztwór NAD⁺(350 pl)

6.    1 M wodny roztwór etanolu (200 pl)

Materiały pomocnicze i aparatura

Liofilizator, zamrażarka -80°C, spektrofotometr, pipety automatyczne, kuwety, szpatułki, mikromieszadło

Studenci rozpoczynają ćwiczenie od etapu C