str62c

ulegają denaturacji, w wyniku czego powstają fragmenty jednoniciowe. Fragmenty te przenosi się na błonę nitrocelulozową i utrwala. Następnie dodaje się wyznakowaną sondę (oligonukleotydy DNA o określonej sekwencji), która zostaje związana z sekwencjami komplementarnymi, tworząc fragmenty dwuniciowe. Kolejnym etapem jest spłukanie nadmiaru sondy. Uwidocznienie, z którymi fragmentami DNA genomowego związała się sonda, możliwe jest przy użyciu kliszy rentgenowskiej. Metoda ta umożliwia wykrywanie delecji powyżej 50 par zasad, insercji i translokacji.

Analiza Northern.

Metoda ta jest podobna do opisanej powyżej. Różnica polega na tym, że w tym przypadku elekroforezie poddaje się mRNA. Ten rodzaj analizy wykorzystuje się m.in. do badania ekspresji danego genu.

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Metoda ta (ang. polymerase chain reaction, PCR) jest jedną z podstawowych technik badawczych i diagnostycznych.

Dzięki tej metodzie możliwe jest powielenie (amplifikacja) w stosunkowo krótkim czasie określonego fragmentu DNA w ogromnych ilościach. W tym celu konieczna jest znajomość sekwencji nukleotydów obu końców odcinka, który chcemy powielić. Umożliwia to zaprojektowanie odpowiednich starterów (ang. primers), którymi są uzyskane na drodze syntezy chemicznej kilkunasto- lub kilkudziesięcio-zasadowe nukleotydy. Startery po przyłączeniu do miejsc komplementarnych w DNA wyznaczają fragment, który ma być powielony. Użycie polimerazy DNA odpornej na wysokie temperatury warunkuje, że enzym nie traci aktywności podczas reakcji.

W tej metodzie cyklicznie powtarza się denaturację cząsteczki DNA (92 -94°C), przyłączanie starterów i syntezę nowej nici pomiędzy starterami (ok. 72°C). Najczęściej cały cykl powtarza się 20 - 30 razy.

Obecnie stosuje się wiele odmian metody PCR (np. RT-PCR, LCR itd.). W zależności od celu, wykorzystywana jest odpowiednia metoda.

Sekwencjonowanie DNA

Stosuje się dwie techniki umożliwiające ustalenie sekwencji nukleotydów w DNA: metodę Sangera (tzw. metoda enzymatyczna) oraz metodę Maxama i Gilberta, polegającą na chemicznej degradacji DNA. W wyniku odpowiednich procedur uzyskuje się pulę znakowanych ołigonukleotydów o różnej długości. Istotne jest takie dobranie parametrów reakcji, aby każdy z czterech nukleotydów występujących w DNA, miał tę samą szansę znalezienia się na końcu fragmentu, Aby rozróżnić fragmenty, prowadzi się elektroforezę w żelu poliakrylamidowym, a następnie np. autoradiografię.

W najnowszych technikach poszczególne nukleotydy są znakowane różnymi lluoroehromami, a sekwencję nukleotydów uzyskuje się w wyniku obróbki komputerowej.

Metody przesiewowe

Służą one do identyfikacji zmian w sekwencjach nukleotydów. Polegają na porównaniu wielkości i/lub konformacji badanych jedno- lub dwuniciowych fragmentów kwasów nukleinowych. We wszystkich metodach powiela się Irngmenty DNA techniką PCR, a następnie rozdziela się za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Analiza heterodupleksów. Polega ona na wykrywaniu parowania pomiędzy pojedynczymi nukleotydami w komplementarnych fragmentach kwasów nukleinowych. Brak parowania, co jest wynikiem mutacji, powoduje zmianę Mtruktury i kształtu cząsteczki. Skutkiem tego tzw. heterodupleksy migrują w żelu / inną prędkością niż tzw. homodupleksy (fragmenty komplementarne na całej długości).

Technika SSCA (ang. single-strand conformation analysis). W literaturze . /yściej jest opisywana jako (single-strand conformation polymorphism). Podobna |i'm! do opisanej powyżej techniki. Różnica polega tylko na tym, że w technice SS< 'A analizuje się szybkość migracji pojedynczych nici DNA. Wykorzystuje się Inki, że zmiana nawet jednego nukleotydu we fragmencie DNA, może wpłynąć na konformację cząsteczki, czego efektem może być zmiana prędkości jej migracji w żelu.

Technika DGGE (ang. denaturing gradient gel eletrophoresis). W tej technice, w żelu poliakrylamidowym, na który naniesiono fragmenty DNA, uformowany jest rosnący gradient czynnika denaturującego, którym może być np. odpowiedni /wiązek chemiczny lub temperatura. Podczas migracji w żelu, fragment DNA dociera do miejsca, w którym stężenie (natężenie) czynnika denaturującego powoduje denaturację podwójnego fragmentu DNA i dysocjację na pojedyncze nici. W tej technice wykorzystuje się zjawisko zależności czasu topnienia DNA od sekwencji nukleotydów w kompleksie.

'Technika ARMS (ang. amplification-refractory mutation system). W tej metodzie mutację wykrywa się poprzez porównanie wyników dwóch niezależnych reakcji PCR. Jeden ze starterów jest wspólny (identyczny), drugi jest komplementarny do sekwencji prawidłowej lub zmienionej w wyniku mutacji. Jeśli produkt reakcji będzie wykryty tylko po użyciu prawidłowego startera, świadczy to o braku mutacji. Wykrycie produktów reakcji wyłącznie w przypadku /.mienionego startera informuje, że mamy do czynienia z mutacją w obu niciach (homozygota); wykrycie produktów PCR w obu reakcjach świadczy o I lelerozygotyczności.

Technika ASO (ang. allel-specific oligonucleotide). Polega na hybrydyzacji pomiędzy powielonymi fragmentami DNA a sondami molekularnymi. Jedna sonda

63