Maśliński4997

Terapia genowa supresyjna zakłada natomiast blokowanie ekspresji da miernie aktywnego, niepożądanego genu, np. onkogenu, odpowiednio przygotow; nym materiałem genetycznym wprowadzanym do komórki. Postępowanie takie m w konsekwencji zmienić fenotyp komórki z patologicznego na prawidłowy. Terapj supresyjna jest często stosowana do hamowania ekspresji onkogenów kluczowych dl danego nowotworu. W blokowaniu ekspresji takiego niepożądanego genu wykorzys tuje się zazwyczaj krótkie, zawierające 12—30 zasad, fragmenty DNA i RNA (oraz icl analogów), czyli oligonukleotydy (ryc. 17.19):

a)    antysensy RNA i DNA,

b)    oligonukleotydy tworzące z DNA potrójną nić (,jriple-helixⁿ)_t

c)    rybozymy,

d)    małe interferujące cząsteczki RNA (smali interfering RNA, siRNA),

e)    aptamery.

Z obliczeń statystycznych wynika, że wybrana kombinacja 12 nukJeolyddw może wystąpić w mRNA tylko raz. W terapiach z użyciem oligonukleotydów stosuje się zwykle sekwencje złożone z 19-23 zasad. Często do komórek docelowych wprowadza się nie tyle cząsteczki oligonukleotydów DNA czy RNA, ile odpowiednio skonstruowane wektory wirusowe, które podlegają stałej transkrypcji w transfeko-wanych komórkach. Produktem są właśnie cząsteczki odpowiedniego oligonukleotydu. wówczas jest to zawsze cząsteczka RNA.

Antysensy RNA i DNA (antysensowe rybo- i deoksyrybonukleotydy) mają komplementarną sekwencję do sensowej mci mRNA, przyłączają się więc do niej

z wytworzeniem dwuniciowych hybryd typu RNA-RNA lub RNA-DNA. Dochodzi tym samym do zahamowania czynności genu na poziomie translacji. Wykorzystuje się przy tym naturalny mechanizm obecny w komórkach, służący do regulacji ekspresji odpowiedniego genu: oprócz transkrypcji sensowej nici DNA i syntezy cząsteczki mRNA właściwej dla danego genu, może dojść także do przepisania nici antysensowej.

W próbach klinicznych z zastosowaniem tych typowych, „konwencjonalnych* antysensów, blokowano np. ekspresję onkogenu BCL-2 (drobnokomórkowy rak płuc, czerniak i szpiczak mnogi), H-RAS (rak piersi), BCR-ABL (białaczka szpikowa) oraz C-RAF (rak płuc, zaawansowane raki jelita grubego i gruczołu krokowego). Technikami antysensowymi próbuje się też hamować ekspresję czynników wzrostu odpowiedzialnych za unaczynienie nowotworu (VEGF).

Niektóre oligonukleotydy DNA lub RNA (złożone z reguły z zasad pury-nowych) blokują swoiście promotor danego genu (często jest nim onkogen, np. gen czynnika wzrostu), tworząc z nim strukturę trójniciową, tzw. triple-heUx. Dochodzi do blokowania ekspresji genu na poziomie transkrypcji.

Od dawna wiadomo, że niektóre cząsteczki RNA działają autokatalitycznie.

Są to rybozymy (cząsteczki RNA o własności enzymów). Degradują swoiście cząsteczki mRNA i tym samym hamują ekspresję odpowiednich genów na poziomie translacji. Odpowiednio skonstruowane cząsteczki rybozymów posłużyły do klinicznych prób hamowania niektórych onkogenów, takich jak gen receptora fltl dla VEGF (tzw. angiozymy) oraz K-RAS. Poza onkologią, przy użyciu rybozymów podjęto próby degradacji wirusa HIV oraz blokowania białek E6 i E7, wytwarzanych przez onko-genne szczepy wirusa brodawczaka.

Małe interferujące cząsteczki RNA (siRNA) rozpoznają swoiste sekwencje mRNA i powodują ich następczą degradację; zachodzi „wyciszanie genów*' na poziomie translacji. Wykorzystuje się tu naturalne zjawiska: odpowiedź komórki na infekcję retrowirusami (ich genom to przecież zawsze podwójna nić RNA) oraz fizjologiczny mechanizm wewnątrzkomórkowego, posttranskrypcyjnego wyciszania genów (Fire i Mello, nagroda Nobla w 2006 r.).

Podwójna nić RNA jest rozpoznawana przez obecny w cytoplazmie kompleks enzymatyczny o nazwie Dicer, który tnie ją na mniejsze części, tzw. dupleksy RNA zawierające 21-23 par zasad. Tak powstają właściwe cząsteczki siRNA, których pojawienie się aktywuje inny zespół enzymatyczny, kompleks wyciszający o nazwie RISC (RNA-Induced Silencing Complac). RISC rozplata i rozcina dupleksy siRNA. Powstała pojedyncza nić służy kompleksowi RISC jako matryca, przyłącza bowiem cząsteczki mRNA o komplementarnej sekwencji. RISC degraduje je i hamuje w ten sposób ekspresję odpowiedniego genu. Cząsteczki siRNA działają dużo skuteczniej niż konwencjonalne antysensy. Ta technika znajduje się obecnie w fazie badań przedklinicznych.

Aptamery są to niekodujące sekwencje RNA, tworzące ugrupowania przestrzenne pasujące do odpowiednich cząsteczek białka, analogicznie do wiązania antygenu przez przeciwciało (z tym jednak, że aptamery wiążą białka o wiele silniej, a sama reakcja zachodzi wewnątrzkomórkowo). Dochodzi do zablokowania ekspresji wybranego genu, np. onkogenu należącego do czynników transkrypcyjnych, w mechanizmie posttranslacyj nym.

Początki tej techniki wiążą się z próbami leczenia zakażenia HIV za pomocą oligoiybonukleotydów (tzw. pułapek RNA), zbliżonych budową do RNA wirusowego, które wychwytywały i unieczynniały białka wirusowe należące do grupy tzw. czynników transaktywujących. Z czasem zaczęto konstruować oligorybonukleotydy o bardzo wysokim powinowactwie do odpowiedniego białka. Niektóre z aptamerów (np. pe-gaptanib sodu hamujący swoiście VEGF) znalazły zastosowanie kliniczne (w zwyrodnieniu plamki żółtej siatkówki).

Opisano wiele ograniczeń terapii genowej (niedostateczna wydajność i słaba swoistość transfekcji, groźba uaktywnienia się wektora wirusowego w organizmie cho-

969