49808 IMG 1404014808

-sS^nM

N^I

^eCo

K^Hu

⁹.***<£2v

^sC

wmieszanie _{w proporv},, ^!ad3 ^,ub analogiczni^ ^wy> cybynianowj’, njfe fbranowy oraz cala grać is. Gekawy jest bufor k ^rsocjację kwasu ortofefe Jcresie pH, od 6 doki’-doskonałymi^^-'

^naifnn₁

, _lub podciśnieniowy. Ciekawą metodą zatężanla roztworu białka wobec stałego PEGu 20 000. Pr zez membranę nie jer* _w etanie jest dtó*¹' _wać ^ białko, ani ogromne łańcuchy PEGu, Łatwo opuszcza »^,rze i st woreczel dializacyjny woda i Inne składniki nlakocząsteczkowe.

I _liaton^1ia _{ocl? zai}-ówno zatężania, jak i oczyszczania białka oraz wymiany I ^Zów należy uznać wytrącanie białka („przetrącanie") za pomocą stęź*>-bi'f°^r0 _ztworu siarczanu amonu. Osad białkowy (można następnie przemyć napuścić _do pożądanego stężenia w nowym buforze.

Pomiar stężenia białka

twór białka do krystalizacji ma zwykle stężenie 10-20 mg/ml. Stężenie h°lka wyznaczamy spektrofotometrycznic, najczęściej po dużym rozdeń-^aia j_u Zazwyczaj wykorzystuje się absorpcję tJV. jako chrornofory mogą Tżvć grupy peptydowe, lecz absorbują one w bardzo niewygodnym ultra-I fiolecie próżniowym (190 nm). Dlatego rejon ten wykorzystuje się rzadko, hoć jest on bardzo ciekawy, gdyż pozwala rozróżnić struktury a i p. Najgęściej wykorzystuje się silną absorpcję pierścieni aromatycznych trypto-fanu i tyrozyny, dla których maksimum bardzo silnej absorpcji przypada na 280 nm. Jeśli znamy liczbę reszt tryptofanu nw oraz tyrozyny nr w sekwencji białka oraz jego masę molowa M„ wówczas na podstawie absorpcji promieniowania na drodze 1 cm możemy wyznaczyć stężenie białka c*, gdyż dla wartości c = 1 mg/ml absorpcja wyniosłaby (5690 •    +1280 • nr)/M_r.

Niezwykle korzystną, choć rzadką sytuację mamy w przypadku białek zawierających naturalne chrornofory grup prostetycznych, np. absorbujący w zakresie widzialnym czerwony hem.

Często do pomiaru stężenia wykorzystuje się kolorymetryczną metodę Bradford opartą na tworzeniu barwnego kompleksu białka z błękitem Co-omassie, wykazującego maksimum absorpcji przy 595 nm. Metoda Bradford wymaga wyznaczenia krzywej wzorcowej, najczęściej dla albuminy osocza wołowego ( BovineSerum Albumin, BSA).

Właściwości kryształów białek

Na pozór kryształy białek wyglądają podobnie do innych kryształów. Jednak jest coś, co różni je zasadniczo od kryształów innych substancji, w svn o-jej objętości zawierają one ogromne ilości roztworu macierzystego, w a ają ^ce się od 30-80%. Z tego względu lepsze może byłoby określenie: ^uP^or2^ kowany żel lub stężony roztwór. Obecność całych „oceanów i ^dna ° wodnych powoduje izolację poszczególnych molekuł w krysztale ora