img110 3

Muicrinł: Cytoaol komórek wątroby s/czuru u/yikuny pf/« z mu lumlc/jit) homogenizację skrawka tkanki w izoionic/nym ro/i worze sacharozy (0,25 M) i wirowanie (100000 • g, 30 min).

()de/ynniki:

1)    !*oly(A)-Scpharose 4B.

2)    0,1 M roztwór NaCI.

3)    Bufor do trawienia RNA: 20 gg/ml RNazy A i 4 IF/ml RNa/y I w układzie: 20 mM Tris/IICl - 0,15 mM KCI - 5 mM MgCI₂ - 5 mM 2-mcrkaptoctanol - 0,25 M sacharoza (pH 7,6).

4)    Bufor startowy: 30 mM Tris/HCI - 1 mM EDTA - 0,1 M ditiotrcitol (pH 8,3).

5)    Bufor do cłucji I: 30 mM Tris/HCI - I mM EDTA - 0.1 M ditiotrcitol - 0,05 M KCI (pH 8.3)

6)    Bufor do clucji II: 30 mM Tris/HCI - 1 mM EDTA - 0.1 M ditiotrcitol - 1 M KCI (pil 8.3).

7)    Bufor do clucji III: 30 mM Tris/HCI - 1 mM EDTA - 0,1 M ditiotrcitol - 0.5 M KCI - 50% (v/v) formamid (pH 8.3).

8)    90% roztwór formamidu w 30 mM buforze Tris/HCI (pH 9,0).

Wykonanie: Odważyć 1 g złoża Poly(A)-Sepharose 4B i zalać 0,1 M roztworem NaCI (10 ml). Pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 min w celu spęcznienia Żelu, a następnie upakować żel w plastikowej kolumnie (5-10 ml) i dodatkowo przemyć 0,1 M roztworem NaCI (10 ml). Kolumnę zrównoważyć następnie buforem startowym (50 ml). Cytosol komórek wątroby szczura (1 ml) zmieszać z buforem do trawienia (19 ml) i inkubować (w temp. 37°C przez 30 min). Mieszaninę inkubacyjni odwirować i supernatant nanieść na wcześniej przygotowaną kolumnę. Usuną* niespecyficznie zaadsorbowane cząsteczki, przemywając kolumnę buforem starli* wym (50 ml), a specyficznie związane cząsteczki wycluować, stosując w tym celu bufory do elucji I, II i III (każdy po 20 ml). Materiał wypływający z kolumny zbici.u w postaci 2-mililitrowych frakcji. Kolumnę przemyć buforem Tris/HCI (40 ml) zawierającym duże stężenie formamidu (90%), a następnie buforem startowym (50 ml) i przechowywać w temp. 4°C nie dłużej niż 30 dni. Za pomocą metody spcktrofotometryczncj (/ = 280 nm) zidentyfikować frakcje zawierające białko. Dal szą analizę uzyskanych preparatów białek wiążących się z mRNA można prowadza metodami elektroforetycznymi oraz immunoenzymatycznymi. Można również uzyn kane białko wykorzystać do przeprowadzenia testu hybrydyzacji z mRNA.

4.7.3. Chromatografia kowalencyjna jako szczególny przypadek chromatografii powinowactwa

Chromatografia kowalencyjna znalazła szczególne zastosowanie w przypadku izo lowania cząsteczek zawierających grupy tiolowe. U podstaw tego rodzaju chromatografii powinowactwa leży możliwość utworzenia kowalencyjnego wiązania między cząsteczkami, które zawierają grupy tiolowe, z wolnymi grupami tiolowymi znaj dującymi się w obrębie złoża. Wiązanie takie jest spontaniczne i odwracalne.

Ćwiczenie 4.32. Izolowanie białek erytrocytarnego pasma 3, zawierających wolne grupy —SU (A. Kahlenberg, C. Walker 1976: Anal. Biochem., 74:337-342)

Zasada: Białka pasma 3, czyli BPA (białka przenoszące aniony), należą do rodziny tioglikoprotcin znajdujących się w błonach erytrocytów. Biorą one udział w trans porcie jonów przez błonę erytrocytu. Izolowanie ich tradycyjnymi metodami jest dość trudne i często prowadzi do uzyskania preparatów /.denaturowanego białka. Kowalencyjna chromatografia powinowactwa pozwala stosunkowo łatwo, w jednym etapie, wyodrębnić te białka w postaci aktywnej.

Mutcruił: Erytrocyty krwi człowieka lub świni.

Odczynniki:

1)    Aktywowane złoże Thiol-Scpharosc 4B.

2)    10% roztwór Tritonu X-100.

3)    0,9% roztwór NaCI (sól fizjologiczna).

4) Bufor startowy: 10 mM Tris/HCI - 100 mM NaCI - 1 mM EDTA (pH 7,5).

5) Bufor do clucji: 10 mM Tris/HCI - 100 mM NaCI - 1 mM EDTA - 20 mM L-cysteiny (pH 8.0).

6)    Bufor do regeneracji złoża: 10 mM Tris/HCI - 1,5 mM dwusiarczek dipirydylu (pH 8.0). liwaga! Wszystkie bufory przygotować korzystając z H₂0 dobrze odpowietrzonej i pozbawionej jonów.

Wykonanie: Erytrocyty (5 ml) przemyć 3-krotnie solą fizjologiczną i dokonać ich lizy w odpowietrzonej H₂0. Przemyć błony erytrocytów i zawiesić w buforze startowym (10 ml) z dodatkiem Tritonu X-100 (0,1%). Ekstrakcję białek błonowych prowadzić w temperaturze pokojowej przez 2 godz. Po zakończeniu inkubacji mieszaninę odwirować, a supernatant zebrać i przechować do dalszych etapów preparatyki. Odważyć 1 g złoża, tj. Activated-Thiol-Sepharose 4B, nanieść na szklany filtr i przemyć H₂0 destylowaną i odpowietrzoną (200 ml). Bezpośrednio potem upakować żel w szklanej kolumnie i zrównoważyć buforem startowym (50 ml). Przez tak przygotowaną kolumnę przepuścić uzyskany uprzednio ekstrakt białek błonowych erytrocytów. Stosując bufor startowy (50 ml), usunąć z kolumny niespecyficznie zaadsorbowane cząsteczki i przystąpić do wymywania kowalencyjnie związanego materiału za pomocą buforu do elucji (20 ml). Wypływający / kolumny materiał zbierać w 1-mililitrowych porcjach i określić spektrofo-tometrycznie (ż. = 280 nm) frakcje zawierające białka pasma 3. Kolumnę przemyć buforem do regeneracji złoża (50 ml) i ponownie zrównoważyć buforem startowym (50 ml). Można ją użyć ponownie lub przechowywać 1 miesiąc w temp. 4°C.

4.7.4. Chromatografia chelatująca jako szczególny przypadek chromatografii powinowactwa

U podstaw tego rodzaju chromatografii powinowactwa leży możliwość odwracalnego wiązania (chelatowania) jonów metali przez specjalnie przygotowany nośnik. Jony metali (Zn, Cu, Cd, Hg, Co lub Ni) związane ze złożem mogą z kolei specyficznie adsorbować peptydy i białka wykazujące do nich powinowactwo. Jako nośnik stosuje się zwykle złoże Epoxy-activated Sepharosc 6B, do którego można trwale przyłączać ligand chelatujący jony, np. kwas iminodioctowy, albo gotowe złoże Chelating Sepharose 6B, które ma związany z powierzchnią ligand zdolny do tworzenia kompleksów chelatowych z jonami metali.

165