35445 skanuj0008

Przygotowanie surowicy:

Świeżą surowicę ludzką rozcieńcz w probówce Eppendorfa buforem do elektroforezy w stosunku 1:1, dodaj kroplę barwnika.

Rozdział elektroforetyczny:

1.    Wlej do pojemników elektrodowych po 150 ml buforu do elektroforezy.

2.    Wyjmij płytkę z agarozą z opakowania, delikatnie osusz ją bibułą w miejscu naniesienia próbek (od strony katody), w osuszonym miejscu umieść folię ze szczelinami.

3.    Nanieś po 5 pl rozcieńczonej surowicy w każdą szczelinę i pozostaw przez 5 minut w celu wniknięcia prób w żel.

4.    Umieść płytkę z agarozą w komorze aparatu do elektroforezy.

5.    Zamknij aparat, podłącz elektrody do zasilacza, prowadź elektroforezę przez około 30 min przy napięciu 110V. Po skończonej elektroforezie wyłącz prąd i zdemontuj przewody łączące elektrody z zasilaczem.

6.    Na szalce przygotuj mieszaninę:

1.6    ml mleczanu

3.2    ml NAD

1.6    mlINT

3.2    ml PMS

2,4 ml 50mM buforu glicyna—NaOH pH 9,7

7.    Wyjmij płytkę z agarozą i umieść ją na szalce w łaźni wodnej. Inkubuj w temp. 37°C przez 20 min łub do momentu, aż w żelu zacznie pojawiać się tło. Po reakcji opłucz 20% metanolem

z 5% kwasem octowym, umieść w przezroczystym woreczku, zeskanuj i wydrukuj.

Opracowanie wyników:

1.    Na podstawie uzyskanych wyników pomiaru absorbancji oblicz AA = Ao - A_s.

2.    Oblicz aktywność LDH, korzystając z poniższego wzoru:

Aktywność (U/l) = AA/min x 20000

3.    Uzyskane wyniki możemy przeliczyć na jednostki SI (kat/1):

10/1= 16,67 x 10'³ pkat/1

4.    Porównaj uzyskane wyniki z wartościami referencyjnymi:

Dorośli: 120 - 240 U/l (25°^r’)

160 - 320 U/l (30°C)

6