skanuj0001

Potrzebne materiały i sprzęt

-    moździerz i tłuczek porcelanowy, probówki Eppendorfa o poj. 2 ml, końcówki sterylne do pipet ( tipsy),ciekły azot,

-    bufor izolacyjny ((100 mM Tris-HCl pH 8; 0,2% C-TAB; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA, 15mM pirosiarczyn sodu dodawany bezpośrednio przed izolacją do buforu)), mieszanina chloroform/alkohol izoamylowy 24:1; 99,8 % alkohol etylowy; 70% alkohol etylowy;

TE( 1 OmM Tris- HC1, ImM EDTA)

Wykonanie ćwiczenia

1.    Zważyć 100 mg tkanki roślinnej na folii aluminiowej ochłodzonej do temperatury - 170° C

2.    Rozetrzeć tkankę na proszek w schłodzonym wcześniej moździerzu, w ciekłym azocie dolewając azotu w miarę potrzeby tak aby nie dopuścić do rozmrożenia tkanki

3.    proszek przenieść do schłodzonej w ciekłym azocie probówki Eppendorf o pojemności 2 ml.

4.    Do roztartej tkanki dodać 800 pl buforu izolacyjnego podgrzanego do temperatury 65° C

5.    Inkubować zawiesinę w temperaturze 65° C przez 30 min kilkakrotnie mieszając w trakcie inkubacji

6.    Po inkubacji dodajemy do zawiesiny 800 pl mieszaniny chloroform / alkohol izoamylowy (24:1) i mieszamy łagodnie- to robimy pod wyciągiem.

7.    Wirujemy 2 min, 14 000 rpm.

8.    Górną fazę wodną przenosimy do nowej probówki(poj. 2 ml) przy pomocy sterylnego tipsa

9.    Punkty 6,7,8 opcjonalnie powtórzyć jeszcze 2x

10.    Do fezy wodnej po ostatnim czyszczeniu mieszaniną, dodać 1 ml, zimnego etanolu 99,8%

11.    Umieścić probówkę w temperaturze. - 20 ⁰ C na 20 - 40 min

12.    Po tym czasie wirować 10 min, 10 000 rpm 4°C

13.    Odciągnąć delikatnie alkohol, osuszyć dodatkowo przez przytkniecie papierowego ręcznika do brzegu odwróconej do góry dnem probówki (osad powinien pozostać na ściance probówki)

14.    Dodać lml 70% etanolu i ponownie wirować 1 min. 10 000 rpm

15.    Odciągnąć delikatnie alkohol, osuszyć dodatkowo przez przytkniecie papierowego ręcznika

* do brzegu odwróconej do góry dnem probówki (osad powinien pozostać na ściance probówki)

16.    Punktl4 i 15 opcjonalnie powtórzyć jeszcze 2x

17.    Osad suszyć w statywie 10 - 15 min

18.    Do wysuszonego osadu dodać 60 pl buforu TE(pEI = 8,0) i rozpuszczać w łaźni wodnej w 65° C przez 10 min.

19.    Po tym czasie do rozpuszczonego DNA dodać lpl RNA-zy ( lOpg/ pl) i ponownie inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37° C przez 1 godzinę.

20.

21.

0„-A-

Sprawdzić jakość i ilość wyizolowanego DNA na 1% żelu agarozowym ( 2pl DNA + 8 p EĘO + 1 pl 6x LB przy napięciu 80V, 30 min)    ^ ^¹

Oszacować ilość i jakość DNA na podstawie żelu oraz spektofotometrycznie

Wydajność i czystość izolacji DNA można określić za pomocą spektrofotometru. Należy zmierzyć absorpcję przy długości fali 260 (A₂6o) '■ 280nm (A₂₈₀). Trzeba tak dobrać rozcieńczenie DNA by odczyty absorpcji znajdowały się pomiędzy 0.1 - 1.0 - są wówczas dokładne. Absorpcja 1.0 przy 260nrn odpowiada 50pg DNA w m.ililitrze (A₂₆₀= 1 = 50|ig/ml). Zalecane jest obejrzenie absorpcji w zakresie 220-320 nm pozwala to oszacować czy inne czynniki takie jak obecność polisacharydów czy' też metabolitów wtórnych nie zakłócają odczytów. Czystość DNA szacowana jest ze stosunku A_26o/A₂₈₀. Czysty DNA posiada stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ w zakresie 1.7-1.9. Spektrofotometrycznie mierzony jest zarówno DNA i RNA. Jeżeli więc w preparacie obecny jest RN A wówczas wyniki pomiarów są zniekształcone.

W przypadku gdy chcemy oznaczyć dokładną zawartość samego DNA w próbie zanieczyszczonej RNA należy użyć fluorymetru, który' detektuje tylko DNA.