68646 SCAN0460

Kolorymetryczne metody oznaczania zawartości białka.

Metoda Lowry’ego. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań peptydowych oraz obecność aminokwasów aromatycznych.

Metoda ta składa się z 2 etapów:

-    w pierwszym zachodzi reakcja biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania peptydowe i Cu ²⁺ oraz redukcja jonów miedzi Cu ²⁺ do Cu ⁺ w środowisku zasadowym).

-    W drugim etapie metody jony miedzi Cu ⁺ katalizują reakcję utlenienia przebiegającą głównie z udziałem tyrozyny i tryptofanu redukując odczynnik Folina-Ciocalteu, czyli kwasy:

fosforomolibdenowy i fosforowolframowy do odpowiednich niebieskich tlenków. Stężenie barwnego kompleksu można mierzyć przy długości fali w zakresie od 500 do 750 nm.

Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje się najczęściej z krzywej wzorcowej. Przy tym dla uzyskania właściwych wyników niezmiernie ważny jest dobór białka wzorcowego do sporządzania tej krzywej. Powinno ono zawierać w cząsteczce zbliżone ilości tyrozyny i tryptofanu w stosunku do badanego białka.

Zaleta metody jest jej znaczna czułość. Można stosować ją bowiem do oznaczenia ilość białka już od 10 g w próbie, a zależność proporcjonalną między intensywnością zabarwienia roztworu, a stężeniem białka obserwuje się nawet przy większych stężeniach - do 1000 g.

Wada metody jest błąd oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w odniesieniu do białka oznaczanego (np. trypsyna daje 3 razy większe natężenie barwy niż żelatyna, przy tych samych stężeniach wagowych). Inną wadą metody Lowry’ego jest zawyżanie wyników oznaczania w wyciągach niedializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu przez wolne aminokwasy, niewielkie peptydy, fenole, nitrofenole, w mniejszym stopniu przez puryny i pirymidyny, kwas moczowy, związki zawierające mostki disiarczkowe oraz niektóre detergenty. Z kolei związki takie jak: Zn 2+ , Mg 2+ , (NH 4 ) 2 SO 4 , CCI 3 COOFł, HCIO 4, aceton, etanol, węglowodany, zależnie od stężenia obniżają intensywność barwy kompleksu.

Metoda Lovry⁹ego służy do oznaczania białek rozcieńczonych. Oznaczenie przebiega w dwóch etapach;

- w pierwszym następuje przyłączenie jonów miedzi do białka (reakcja biuretowa),

w drugim etapie kompleks białkowo-miedziowy redukuje odczynnik Folina-Ciocolteau fosforomolibdeniano-fosforowolframowy. W wyniku reakcji tworzy się barwny kompleks, którego absorbancja (mierzona przy 750 nm) jest proporcjonalna do stężenia białka.

Metody spektrofotometryczne wykorzystuje się do oznaczania frakcji rozpuszczalnej w białkach, które decydują o właściwościach funkcjonalnych surowca. Ma to szczególne znaczenie w analizie jakości preparatów białek roślinnych i zwierzęcych oraz przy ocenie mięsa ryb składowanego przez dłuższy czas w warunkach zamrażalniczych.

Oznaczanie ilości białka rozpuszczalnego polega na wyekstrahowaniu białka z próbki za pomocą odpowiedniego buforu, a następnie określeniu ilości białka za pomocą bezpośredniego pomiaru spektrofotometryczngo uzyskanego roztworu, bądź po przeprowadzeniu go w barwny kompleks stosując odczynnik biuretowy (stężenie białka 1-10 mg/ml) czy odczynnik Folina-Ciocolteau (stężenie białka 10-100 u g/ml).

3