24

dy pozwalają oznaczać tylko ortofosforany). Po zmineralizowaniu zawartość fosforu oznacza się identycznie jak fosfor nieorganiczny w surowicy.

Odczynniki:

1)    Stężony roztwór H₂S0₄.

2)    Stężony roztwór HC10₄.

3)    10% roztwór NH₃.

4)    Odczynniki do oznaczania fosforu nieorganicznego {patrz ćw. 12.48 i 12.49).

Wykonanie: Do kolbki Kjeldahla wprowadzić 2 ml H₂0 i 0,2 ml surowicy [w metodzie z chlorkiem cyny(Il) (cynawym)] lub 1 ml surowicy (w metodzie Fis-ke- Subbarowa) oraz 1,5 mkstężonego roztworu H₂SG₄. Po kilkunaslominutowym ogrzewaniu zawartość kolbki przybiera postać brunatnej, oleistej cieczy, należy wtedy dodać kilka kropli 60% roztworu HC10₄ i ogrzewać przez, kilka minut do całkowitego odbarwienia roztworu. W celu całkowitego rozłożenia HC10₄ (w przeciwnym razie może nie powstać zabarwienie po dodaniu odczynnika redukującego) należy dodać 2 4 ml lt₂0 i ogrzewać do całkowitego jej odparowania, przez kilka minut. Czynność tę powtarza się kilka razy.

Po zmineralizowaniu do kolbki dodać 5 ml H₂0 i ogrzać do wrzenia w celu przeprowadzenia difosforanów(V) (pirofosforanów) w ortofosforany(V), po czym po ostudzeniu przenieść ilościowo do kolbki na 10 ml i uzupełnić wodą do kreski. Pobrać z kolbki 2,5 ml, zobojętnić wobec p-nirofenolu 10% roztworem amoniaku do żółtego zabarwienia, a następnie odbarwić roztwór przez dodanie 1-3 kropli 2,5 M roztworu H₂SC)₄. Dalsze postępowanie identyczne jak przy oznaczaniu fosforu nieorganicznego w surowicy (patrz ćwicz. 12.48 i 12.49). Oblicza się analogicznie, a otrzymany wynik mnoży się przez 2. Wartości absorbancji odczytywać wobec próby kontrolnej, zmineralizowancj równolegle z roztworem badanym.

Ćwiczenie 12.51. Oznaczanie fosforu estrowego

Zasada: Oznacza się fosfor rozpuszczalny w środowisku kwasowym, będący sumą fosforu zestryfikowanego i fosforu nieorganicznego. Odejmując od lej sumy zawartość fosforu nieorganicznego, otrzymuje się ilość fosforu zestryfi kowanego. Aby estry fosforowe mogły wejść w reakcję, należy je przeprowadzić przez mineralizację w fosforany!V) nieorganiczne.

Odczynniki:

Jak przy oznaczaniu fosforu całkowitego i nieorganicznego.

Wykonanie: 0,2 ml krwi [w metodzie z chlorkiem cyny(Il) (cynawym)] lub 1 ml krwi (przy metodzie Fiske-Subbarowa) uzupełnić wodą do 5 ml. Po 5 minutach dodać 5 ml roztworu CCl₃COOH. Wymieszać. Po 10 minutach przesączyć. 4 ml przesączu /.minerałizować w kolbce Kjeldahla z I ml stężonego roztworu łł₂S0₄. Dalsze postępowanie jak w ćw. 12.50, z tą różnicą, że otrzymany wynik mnoży się nie przez 2, a przez 5.

Oznaczenie fosforu lipidowego — patrz ćw. 8.7.

12.5. KRZEPNIĘCIE KRWI 12.5.1. Hemostaza ogólna

Organizmy w ciągu długiego okresu ewolucji wytworzyły wiele mechanizmów obronnych. Jednym z nich jest zjawisko hemostazy. Terminem tym określa się złożony ciąg reakcji prowadzących, z jednej strony do utrzymania płynności krwi krążącej w naczyniach krwionośnych, a z drugiej strony — do tamowania krwawienia w przypadku przerwania ciągłości naczyń. Obok licznych aktywatorów i inhibitorów białkowych szczególną rolę w tym zjawisku odgrywają: 1) płytki krwi (tworzenie pierwotnego czopu hemostatycznego, por. podroż,d/,. 12.6), 2) naczynia krwionośne (skurcz i interakcja z płytkami} oraz 3) osoczowe czynniki (cz.) prokoagu-lacyjne biorące udział w przekształceniu rozpuszczalnego białka krzepliwego, fib-rynogenu w fibrynę (włóknik). Zalicza sic lu również jako składnik 4) układ fibrynolityczny, który działa także za pomocą specyficznych czynników osoczowycb i ma zadanie upłynniania powstałych skrzepów, jeżeli stanowią one zagrożenie dla prawidłowego przepływał krwi w naczyniach krwionośnych.

W pierwszej kolejności zostaną omówione pokrótce białka biorące udział we wstępnych etapach procesu hemostazy, które są oficjalnie uznane za czynniki prokoagulacyjne i oznakowane cyframi rzymskimi I-XIII. W ostatnich latach okazało się, żc bardzo istotną rolę w inicjacji procesu krzepnięcia odgrywają dwa dalsze białka znane jako: 1) wielkocząsteczkowy kininogen (\VK) oraz 2) prekalik-reina (proenzym aktywowany do kaiikrciny przez plazminę lub cz. XIla).

Ogólną charakterystykę najważniejszych osoczowych czynników prokoagulacyj-nych umieszczono w lab. 12.2. Z wyjątkiem czynników: I (fibrynogen), III (czynnik tkankowy o charakterze glikoproteiny), IV (jony wapnia), V i VIII (kofaktory) oraz XIII (transglutaminaza), pozostałe mają charakter proenzymów proteolitycznych i w kaskadzie przekształceń ulegają przemianie do proteaz serynowych. IJ podstaw tego zjawiska leży proces spontanicznej proleolizy poszczególnych cząsteczek obejmujący hydrolizę 1 lub 2 wiązań peplydowych (amidowych). Towarzyszące temu wydarzeniu zmiany konformacyjne prowadzą do odsłonięcia centrum aktywnego, a tym samym do pojawienia się właściwości enzymatycznych (aktywacja proenzymu do enzymu). Każdy powstały w ten sposób enzym działa na proenzym położony niżej w drabinie czynników krzepnięcia, który stanowi dla niego fizjologiczny substrat. Na tej zasadzie np. cz. XII. lokowany na szczycie kaskady w układzie wewnątrzpochodnym, przekształcany jest przez odpowiedni aktywator (kolagen, kałikreina, plazmina) do czynnego enzymu, tzn. cz. XIIa. Ten aktywuje XI --*• XIa. Fizjologicznym substratem dla ostatniego jest cz. IX przechodzący w cz. IXa. Zaobserwowano, ż.e cz. IXa skutecznie aktywuje właściwy dla siebie proenzym, tj. X —> Xa, jeżeli w środowisku występują: cz. VIIla (kofaktor). Ca²'⁴' i fosfolipidy (PL). Taki zestaw współdziałających ze sobą składników nosi nazwę tenazy (ten - 10), jako że substratem jest cz. X konwertowany do cz. Xa. Ten ostatni z kolei, jako enzym współdziałający z czynnikiem Va, Ca"⁺ i fosfolipidami błony płytkowej, tworzy kompleks protrombinazy, który działa na protrombinę przekształcając ją w czynną trombinę. Funkcjonuje on w jednakowy sposób niezależnie od tego, czy

623