41

V, białka = V

Składniki soli natomiast wnikają bez trudu do rozpuszczalnika wypełniającego pory sefadeksu i dlatego wędrują znacznie wolniej. Ich objętość elucyjna będzie więc suma objętości rozpuszczalnika nie związanego z żelem (V₀) i związanego z żelem (IĄ).

V_esoli^V₀+V_i

Przebieg procesu odsalania kontrolowany jest przez oznaczanie rozdzielanych składników w eluacie z kolumny. Podstawy różnych metod chromatograficznych omówiono na str.

Odczynniki

1.    Sephadex G-25 drobnoziarnisty (fine).

2.    Odczynnik Nesslera (wykonanie patrz str. 131).

3.    Odczynnik miedziowy (patrz str. 20).

4.    Odczynnik Folina (wykonanie patrz str. 131).

5.    2,5-proc. roztwór białka w 5-proc. siarczanie amonowym.

Szkło i inne pomoce

Na 2 studentów przypada: 1 kolba miarowa na 10 ml, 1 kolba miarowa na 50 ml, 1 kolumna chromatograficzna wypełniona żelem Sephadex G-25, 1 pipeta serologiczna na 10 ml, 1 pipeta chemiczna na 5 ml, 1 pipeta serologiczna na 1 ml, 1 mikropipeta na 0,1 ml, 26 probówek laboratoryjnych, 20 probówek małych.

Wykonanie

Ćwiczenie wykonuje się w zespołach 2-osobowych. Studenci oddzielają białko od soli amonowej na kolumnie z Sephadeksem G-25, ponadto oznaczają zawartość białka w roztworze wyjściowym nanoszonym na kolumnę oraz w eluacie, a także wykrywają jony amonowe.

1.    Sporządzanie kolumny. Kolumnę formuje się z uprzednio napęczniałego wodą żelu Sephadex G-25 (1). Rurę chromatograficzną o wymiarach dostosowanych do rodzaju rozdzielanej mieszaniny (długość) i ilości substancji (średnica) zawierającą przy wylocie zwitek z waty szklanej umocować pionowo w statywie i napełnić jednorazowo żelem do wysokości ok. 20 cm. Na powierzchni żelu ułożyć delikatnie krążek z bibuły filtracyjnej w celu zabezpieczenia kolumny przed uszkodzeniem. Następnie otworzyć kran, aby płyn wyciekał z szybkością 15-20 kropli na minutę i przemywać kolumnę 2-3-krotną objętością wody.

2.    Rozdział na kolumnie (studenci wykonują parami). Wyskalować 20 probówek na 1 ml

1    jedną probówkę na 5ml, następnie wysuszyć je przez wstawienie do góry dnem do statywu wyłożonego czystym arkuszem bibuły. Z przygotowanej kolumny wypełnionej sefadeksem zdjąć zacisk z końcówki i odsączyć płyn znad żelu. Gdy warstwa buforu nad żelem będzie wynosiła ok. 2 mm zakręcić zacisk kolumny, nanieść ostrożnie pipetą (aby nie naruszyć żelu)

2    ml roztworu białkowego (5) i pod wylot kolumny podstawić probówkę wy skalowaną na ml, po czym odkręcić zacisk. Po prawie całkowitym wniknięciu naniesionego roztworu w żel