CIMG4080

Pierwotną budowę białek określa układ aminokwasów w łańcuchu pepty-dowym. Budowę drugo- i trzeciorzędową określa natomiast przestrzenna konfiguracja łańcucha polipeptydowego stabilizowana interakcją aminokwasów przez wiązanie hydrofobowe, wodne, dwusiarczkowe lub ładunki elektrostatyczne. Ta drugorzędowa i trzeciorzędowa budowa białek określa ukształtowanie podjednostek białkowych.

O tym, jak ukształtowany jest prosty wirus składający się tylko z białek i kwasu nukleinowego, można przekonać się w warunkach laboratoryjnych. Dobrym modelem jest wirus choroby mozaikowej tytoniu. W odpowiednich warunkach fizykochemicznych in vitro można rekonstruować cząstkę wirusową z izolowanego wirusowego kwasu nukleinowego i z nie zorganizowanych łańcuchów polipeptydowych, otrzymanych uprzednio z oddzielonego białka wirusowego.

Jak już wspomniano, białka wirusów są zakodowane w genomie wirusa. Jednak oprócz takich białek występują białka pochodzenia komórkowego.

Łącznie wszystkie białka wirionów przedstawiają zbiór antygenów (zarówno białko kodowane przez wirion, jak i nabyte od elementów komórkowych w procesie replikacji), które mogą działać pobudzająco na procesy tworzenia odpowiedzi immunologicznej, w tym w postaci wytwarzania przęciwciąL W konsekwencji niektóre z nich są odpowiedzialne za powstanie przeciwzakaź-nej odporności, a inne nie mają tych właściwości, lecz można je identyfikować właśnie za pomocą surowic odpornościowych. Ich wczesne wykazanie w komórkach pomaga zbadać, w których miejscach określone białka ulegają syntezie.

Niektóre powierzchniowe antygeny białkowe aglutynują krwinki czerwone różnych gatunków zwierząt. Określano je jako hemaglutyniny. Dla celów diagnostycznych są przydatne głównie tzw. antygeny grupowe, nukleoproteiny, które występują u różnych typów wirusów należących do określonego rodzaju. Stwierdzono ich obecność u wirusów grypy, adenowirusów, retrowirusów, echowirusów, pokswirusów, a wykorzystywano w różnych metodach diagnostycznych (p. rozdz. 10 - Diagnostyka wirusologiczna).

Na oddzielną wzmiankę zasługują białka wirusowe występujące u niektórych wirusów, a obdarzone właściwościami enzymatycznymi.

Neuraminidaza ortomyksowirusów i niektórych paramyksowirusów odgrywa określoną rolę przy przenikaniu wirusa przez powierzchnię wrażliwej komórki i przy uwalnianiu potomnych wirusów z komórki.

Adenozynotrifosfatazę wykazano w osłonce wirusa klasycznego pomoru drobiu, choroby Newcastle, ptasiej mieloblastozy, w wirusach herpes i kro-wianki.

Endonukleazę stwierdzono u wirusa NDV, a rewersyjną transkryptazę u onkogennych RN A wirusów ptaków i ssaków.

Polimeraza RNA występuje u ortomyksowirusów, rabdowirusów, retrowirusów, pokswirusów i innych.

Niektóre z tych enzymów są kodowane w genomie wirusa (np. neuraminidaza, rewersyjną transkryptaza, polimeraza). Inne są pochodzenia komórkowego.

Białka wirusowe można izolować z wirusów w zasadzie podobnymi metodami, jak kwasy nukleinowe, jednak z określonymi modyfikacjami. Po dezinte: gracji wirionu białko oddziela się od kwasów nukleinowych i poddaje dalszym

oczyszczeniom przez dializę, wytrącenie etanolem, siarczanem amonowym, polietyloglikolem, wirowaniem w gradiencie gęstości, chromatograficznie itd.

Po oczyszczeniu białek od zbędnych związków, w tym użytych odczynników, można przystąpić do frakcjonowania zawiesiny białkowej na poszczególne polipeptydy. U izolowanych polipeptydów można następnie przeprowadzić analizę ich składu aminokwasowego, sekwencji składników.

Mieszaninę polipeptydów można frakcjonować, wykorzystując ich zróżnicowanie w wartościach masy cząsteczkowej i ładunków elektrycznych. Bardzo przydatną metodą rozdzielania białek, z zachowaniem ich nie naruszonych właściwości, jest elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. W elektroforezie cząstka naładowana wędruje w polu elektrycznym z szybkością zależną od gęstości ładunku elektrostatycznego. Jeżeli zastosuje się jako nośnik poli-akrylamid, to występuje rozdział wg wielkości, gdyż przy polimeryzacji akryl-amidu wytwarza się sito molekularne. Im większe jest stężenie akrylamidu, tym bardziej gęste wytworzy się sito poliakrylamidowe.

W odpowiednim sicie molekularnym i elektroforezie, przebiegającej w środowisku detergentów (np. SDS), dochodzi do rozdzielenia cząstek wg ich wielkości. Przyczyną jest związanie SDS z wolnymi grupami na polipeptydzie, co powoduje, że wszystkie polipeptydy mają jednakowy ładunek. W następstwie wszystkie cząstki w polu elektrycznym wędrują jednakowo, a ujawnia się działanie sita molekularnego. Oznacza to, że tą metodą można określić względną gęstość białek.

Przydatna jest dwukierunkowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (wg Farrella). W tej metodzie wykorzystuje się dwie zasady rozdziału: ruchliwość polipeptydów na podstawie ich ładunku elektrycznego oraz ruchliwość w zależności od wielkości cząstek.

Elektroforeza jest metodą powszechnie stosowaną do analizy białek, gdyż jest przystępna i daje dobre wyniki pomiarowe. Wprowadzono również jej mikrotechniczne warianty (ultracienkie żele grubości 0,05-0,25 mm i o rozmiarach 6x5 cm).

LIPIDY I SACHARYDY

Tłuszcze i sacharydy obecne w wirionach pochodzą z komórek gospodarza, w których zachodziła replikacja wirusa. Są wiązane z białkami jako lipo-proteiny oraz kompleksy glikoproteinowe.

U wirusów z osłonkami lipidy tworzą podwójną warstwę. To stabilizuje wirion. Do warstwy takiej, np. u ortomyksowirusów, są przymocowane gliko-proteiny hemaglutyniny i neuraminidazy.

Piśmiennictwo

1. Cann A.J.: Principles of molecular virology. Acad. Press, London, San Diego, New York 1993. - 2. Carrasco L.: Modification of membranę permeabilily by animal virus.es. Adv. Virus Res., 1995,45, 61.-3. Fields B. N., Knipe D. M.: 'Fundamenta! Virology. Rave. Press, New York 1986. -4. Osierman L.A.: Methods of protein and nucleic acid research, vol.T a 2. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo 1984. - 5. Webster R.G.. Granoff A. (eds): Bncydopedia of Yi^ology. Acad. Press, 1994, 3, 1571.

33