CIMG4113

nego i drugiego łańcucha dwuniciowego DNA, nazwano restrykcyjnymi endo-nukieazami. Fragmenty obcego DNA nimi wycięte mogły być rozdzielone za pomocą odpowiedniej elektroforezy żelowej, przydatnej do określenia ich masy cząsteczkowej. Zastosowanie różnych enzymów restrykcyjnych pozwoliło na rozpoznanie mapy genetycznej dawców genów i wektorów przenoszących.

Bakterie wytwarzają również enzym ligazę, istotny dla manipulacji genami. Ma ona zdolność łączenia (spajania) końców nukleotydów DNA w miejscach,

Ryc. 19. Schemat rekombinacji plazmidowej (wg A.E. H. Emery, 1981).

w których rozerwała je endonukleaza restrykcyjna. Po zespoleniu fragmentu DNA dawcy w miejscu wyciętego fragmentu wektora powstały rekombinant DNA za pomocą tego wektora zostaje wprowadzony do bakterii; jeżeli dysponuje właściwym operonem zapewnia ona jego ekspresję. W bakteriach-biorcach dochodzi do tworzenia kopii rekombinantów DNA. Istotne są te, które prowadzą do ekspresji genów, których produktów oczekujemy. Ponieważ nie wszystkie fragmenty DNA dawcy kodują oczekiwany produkt, jest niezbędne klonowanie namnażanej hodowli bakterii (z rekombinantem DNA) tak, aby wyodrębnić pożądane kolonie z daną ekspresją. W dużym uproszczeniu cykl sprowadza się do pobrania właściwego genu z DNA dawcy, wbudowaniu w DNA nośnika, wprowadzeniu do biorcy i uzyskaniu oczekiwanej ekspresji. Dla komórek prokariotycznych przydatnym nośnikiem jest plazmid lub bakteriofag, a dla komórek eukariotycznych - wirusy w nich się rozmnażające. Na ryc. 19 przedstawiono najistotniejsze elementy postępowania prowadzącego do uzyskania ekspresji określonego genu.

Metodami klonowania i rekombinacji genów, ich ekspresji w różnych komórkach uzyskano już w latach osiemdziesiątych wiele produktów, które weszły do szerokiego zastosowania w diagnostyce (np. antygeny wirusowe i drobnoustrojowe), w profilaktyce (szczepionka przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby B, interferony) i w leczeniu (np. hormon wzrostu, insulina, interferony, witaminy, immunomodulatory).

Dawcą określonego genu może być fragment RNA. Wówczas za pomocą odwróconej transkryptazy uzyskuje się odpowiednie DNA, a za pomocą poli-merazy DNA odtwarza drugi łańcuch DNA, wreszcie nukleazą odcina zbędne nukleotydy tak, aby uzyskać kopię właściwej cząsteczki DNA. Wbudowana do komórki dawcy będzie mogła ujawnić swój gen, jego ekspresję w postaci oczekiwanego produktu.

Do często stosowanych, od pierwszych lat, należą komórki E. coli K 12, a wektorami są plazmidy i fag lambda. Spośród licznych, znanych enzymów restrykcyjnych stosowana jest szczególnie często Eco RI z E. coli RY 13, rozpoznająca sekwencję DNA i rozszczepiająca w miejscach 5”-G|AATTC-3 jednego i 2-ClTAj G-5' drugiego łańcucha dwuniciowego DNA. Z Bacillus amyloligenfaciens H uzyskano enzym restrykcyjny BamHI, rozszczepiający między nukleotydami 5'-G 1GATCC-3' i 3'-CCTAGT G-5'. Z Haemophilus mfluenżae Rc otrzymano restryktazę 5'-GTPy|PuAC-3 dla jednego łańcucha i 3'-CAPu| PyTG-5'dla drugiego łańcucha DNA. Z innego szczepu tej bakterii otrzymano enzym restrykcyjny nazwany Hind III, rozszczepiający polinukleo-tyd w miejscach 5-A1AGCTT-3' i drugi polinukleotyd DNA w miejscu 3-TTGGA|A-5'(j, = miejsce rozszczepienia, Py, Pu = zasady pirymidynowa i purynowa). Są obecnie enzymy restrykcyjne produkowane komercyjnie, dostępne powszechnie i stosowane do badań naukowych i diagnostycznych.

Piśmiennictwo

1. Cann A.J.: Principles of molecular virology. Acad. Press, London, San Diego, New York 1995, 86. 1 2. Ciampor F.: Role of the cytoskeleton and nuclear matrix during viral infection: a review, Acta Yirol., 1988, 32, 168-173. - 3. Dragunova J., Kożuch O., Gresikova M.: Phenotypic

93