apoptoza013

degradacji dwuniciowego DNA [200, 270, 302j. Enzymy te okazują zdolność wprowadzania jedno- i dwuniciowych pęknięć materiału genetycznego. Chociaż degradacja chromatynowego DNA, towarzysząca apoptozie indukowanej różnymi czynnikami, jest zjawiskiem znanym od wielu lat, to wiedza o enzymach odpowiedzialnych za nią jest wciąż ograniczona. Wiadomo, że trawienie DNA podczas apoptozy obejmuje dwie fazy: 1) doprowadzającą do fragmentów genomu o odcinkach 200 000-300 000 i 20 000--50 000 pz (ang. „<domain nuclease" [561), opisywanych jako HMW DNA (ang. high mol ecu lar w eight DNA) i 2) do odcinków odpowiadających długości nukleosomowego DNA (ok. 180-200 pz) lub wielokrotności (ang. fragmentation nuclease" [56]), oznakowanych jako LMW DNA (ang. I ow m olecular w eight DNA) [200, 262]. Poznane dotychczas endonukleazy komórek apoptotycznych dzieli się na trzy grupy, głównie uwzględniając ich wymagania wobec jonów metali [56, 200, 302] (tab. 23.3): 1) zależne od jonów Ca i Mg \ 2) zależne od jonów Ca² i 3) niezależne od jonów metali (tab. 23.3).

Prawdziwym przełomem w badaniach enzymatycznej degradacji DNA komórek apoptotycznych (HcLa) stało się zidentyfikowanie w 1997 r. w laboratorium X. Wanga [151] tzw. czynnika fragmentacji DNA — DFF, który dokonuje cięć DNA między nukleosomami, tworząc fragmenty LMW. Jego aktywność nukleazową stymuluje obecność histonu HI, białek HMG--1 i HMG-2 oraz topoizomerazy II [153, 271]. Prawic w tym samym czasie w dwóch innych laboratoriach wykryto homologiczne białka o aktywności nuk-leazowej, tj. CAD w komórkach limfoidal-nych myszy [61] i CPAN (ang. caspase--2ictivated nuclease) w komórkach Jurkat [96]. Czynnik DFF komórek HeLa składa się z dwóch podjednostek: katalitycznej i regulatorowej o m.cz. odpowiednio 40 000 (DFF40/CAD) i 45 000 (DFF45/CAD). Analiza struktury pierw-szorzędowej DFF40 komórek ludzkich i CAD komórek mysich ujawniła znaczną homologię ich sekwencji sięgającą 75,9% oraz brak podobieństwa do DNazy I i DNazy II [61, 96, 152].

Podjednostki katalityczne endonukleazy obydwu gatunków są zasadowe: CAD (mysz; 344 aa) wykazuje pl 9,7, natomiast

Tabela 23.3. Główne endonukleazy uczestniczące w przebiegu apoptozy (opracowano na podstawie [56, 176, 200, 270])

Enzym / Wymagania jonowe	Fragmentacja DNA*
	HMW	LMW (drabinka)
Ca^2’/Mg^2-zależne endonukleazy
NUCI 8		+
NUC70		+
26 000		+
32 000		+
97 000	—	+
260000	+	—
DNaza I	—	+
DNaza y	+	+
Mg^2'-zależne endonukleazy
DFF/CAD	+	+
Endonukleazy niezależne od jonów metali
DNaza II	-	+

Chromatynowy DNA w komórkach apoptotycznych może ulegać fragmcntacji do odcinków o dużei masie cząsteczkowej H\1W i malej masie cząsteczkowej LMW