CIMG4151

wskazać na metody służące do wykazania przeciwwirusowej swoistej aktyw-ności immunoglobuliny M. Do najdawniej znanych należą metody oparte na chemicznej inaktywacji immunoglobuliny M. Na przykład merkaptony rozszczepiają cząstki IgM na nieaktywne immunologicznie części przez rozerwanie powiązań łańcuchów polipeptydowych. Mierząc więc np. całkowite miano przeciwciał surowiczych, a równocześnie poddając surowicę ww. działaniu chemicznemu, uzyskuje się różnice mian zależne od obecności lub braku przeciwciał w klasie IgM. Metoda nie jest jednak dokładna i jej zastosowanie w praktyce było krótkotrwałe, chociaż sama technika może być przydatna do rozdzielania immunoglobulin. Metoda, która była i w pewnych sytuacjach jest stosowana, to rozdział w gradientach (np. sacharoza) przy wirowaniu w różnych wartościach g lub rozdział przez sączenie w kolumnach chromatograficznych (np. Sephadex G-200). Po oddzieleniu frakcji IgM następuje określenie aktywności dla określonego wirusa za pomocą innej rekomendowanej metody (np. hemaglutynacja w przypadku zakażenia wirusem różyczki). Powyższe metody były stosowane, lecz ich zbyt duży koszt spowodował, że ustąpiły miejsca bardziej rozpowszechnionym w latach osiemdziesiątych metodom im-munoenzymatycznym, a w pewnych przypadkach immunofluo rescencyj nym (np. zakażenia wirusem Epsteina-Barr).

METODY HEMAGLUTYNACJI, ZAHAMOWANIA HEMAGLUTYNACjl, HEMADSORPCJI, IMMUNOHEMADHERENCJ1

Wiele wirusów (np. o rtomyksowirusy, paramykso wirusy, liczne arbowirusy) ma zdolność aglutynowania krwinek czerwonych. Pozwala to na określenie miana wirusów lub podjednostki, jaką jest hemaglutynina, np. przy ocenie miana szczepionki grypowej.

Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA) wykorzystuje te właśnie zdolności niektórych wirusów do zlepiania, aglutynowania krwinek czerwonych. Jeżeli w badanej surowicy znajdują się przeciwciała dla określonej hema-glutyniny wirusowej, to po dodaniu odpowiednich krwinek czerwonych nie dochodzi do ich aglutynowania przez wirusy. Jednak należy pamiętać, że w surowicach występują związki nieswoiste, tzw. inhibitory hemaglutynacji, które wiążą się na receptorach wirusowych. Można więc uzyskać pozornie dodatnie wyniki, czyli będące skutkiem działania swoistych przeciwciał. Dlatego z surowic przeznaczonych do odczynu zahamowania hemaglutynacji należy uprzednio usunąć nieswoiste inhibitory hemaglutynacji. Do usuwania ich służą różne metody (RDE, kaolin, aceton itd.), w zależności od chemicznych cech inhibitora.

Metody oparte na zjawisku zlepiania komórek i hamowania tego procesu służą więc zarówno do identyfikacji wirusów, jak i przeciwciał przeciwwiruso-wych, w tym umiejscowionych w klasach immunoglobulin. Metody te są wprawdzie w wielu zakażeniach wypierane przez metody tzw. szybkiego rozpoznawania (IF, EL1SA, RIA), lecz ze względu na ich łatwość wykonania mogą być stale rekomendowane w wirusologicznej diagnostyce przyszpitalnej np. zakażeń myksowirusami.

Zasady podobne do wymienionych wyżej obowiązują przy użyciu metody zahamowania hem adsorpcji. W tym przypadku najczęściej stosowanymi systemami wykrywającymi obecność przeciwciał są hodowle komórkowe, uprzednio zakażone odpowiednimi wirusami. Jeżeli w badanej surowicy są przeciwciała swoiste dla danego wirusa, to wprowadzone do takiej zakażonej hodowli blokują powierzchnię komórek zakażonych wirusami; po dodaniu krwinek czerwonych nie dochodzi do ich adsorpcji. Zjawisko hemadsorpcji związane jest bowiem z podstawowym mechanizmem replikacji wielu wirusów, połączonym z ich ekspresją na powierzchni komórek zakażonych (wirusy grypy, parain-fluenzy, nagminnego zapalenia ślinianek przyusznych). Jest to istotne, gdyż nie zawsze replikacja połączona jest ze zdefiniowanym (zależność nie tylko od wirusa, ale i od typu komórek replikujących) obrazem cytopatycznym. Otóż wirusy dojrzewając, następnie pączkując z błony komórkowej, mogą reagować z dodanymi odpowiedniego gatunku krwinkami czerwonymi (ludzkie grupy 0, kurze, świnki morskiej, małpie, gołębie), w zależności od wykrywanego wirusa.

Poznanie zjawisk i opracowanie metod hemaglutynacji i wiązania dopełniacza zostało wykorzystane w opracowaniu odczynu immunohemadherencji. Odczyn ten zastosowany w ubiegłych dziesięcioleciach w zakażeniach pasożytniczych został również dostosowany do rozpoznania niektórych zakażeń wirusowych. Reakcje między antygenem, przeciwciałem, dopełniaczem i krwinkami czerwonymi mogą być również odczytane pod mikroskopem. Reakcja wymaga jednak stosowania stabilizatora w celu zapewniana dostatecznej trwałości połączeń. Zbadano przydatność odczynu w zakażeniach en terowi ru sami, wirusem różyczki, różnymi ar bo wirusami, wirusami wirusowego zapalenia wątroby typu A i B, orto- i paramyksowirusami, herpeswirusami. Technika pozwala też na wykrywanie swoistości przeciwciał po uprzednim rozdziale na klasy immunoglobulin (a więc pośrednio). Nie jest przydatna do wykrywania przeciwciał, które nie wiążą dopełniacza, oraz wymaga oddzielenia hemaglutyniny, co eliminuje możliwość stosowania wirusów hem aglutynuj ących; zastosowanie w wirusologicznej praktyce diagnostycznej jest sporadyczne.

METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ

Wiele osiągnięć biologii molekularnej znalazło przydatność w szeroko pojętej diagnostyce zakażeń wirusowych. Wyodrębniły się dwa kierunki. Jeden z nich oparty jest na charakterystyce genomu wirusa, drugi - struktur białkowych.

Metody molekularne są coraz powszechniej stosowane, zwłaszcza w wyniku opracowanych i produkowanych przez wiele firm zestawów diagnostycznych łatwych w użyciu i zapewniających wysoki stopień czułości i swoistości, a także bezpieczeństwo w wykonywaniu pomiarów w diagnostyce licznych zakażeń (rętrowirusy, herpeswirusy, myksowirusy, enterowirusy itd.). Stosowane są również w badaniach poświęconych ewolucji wirusów, w pracach nad szczepionkami najnowszych generacji.

Do metod tych należą: analiza elektroforetyczna genomów wirusowych (np. wirusów polio „dzikich", atenuowanych, pochodnych, rekombinantów), określana jako mapowanie oligonukleotydów (ang. RNA fingerprinting). Po-

167