DSC00150 (25)

azotu_przez__licd2e_j6_A25_(=10Q/16). Metoda ta jest szeroko rozpowszechniona pomimo błędu, jaki zawiera, bowiem nie cały azot ma pochodzenie białkowe.

2.8.1. Wyznaczanie masy cząsteczkowej białek

Ola biopolimerów, jakimi są między innymi białka, niemożliwe staje się określenie masy cząsteczkowej tradycyjnymi metodami, jak podwyższenie punktu wrzenia czy obniżenie punktu krzepnięcia. Z tego względu do oznaczania biopolimerów stosowane są metody chemiczne i fizykochemiczne.

Metody chemiczne opierają się_na_oznaczaniu.jednego.określonego^ pierwiastka w biątku^Można. w ten sposób określić na przykład masę. hemoglobiny..z ustalonej uprzednio procentowej zawartości .żelaza.(Fe II).„Można też obliczyć masę cząsteczkową białka_wyko-rjystując procentową zawartość aminokwasu występującego .w .białku w najmniejszej ilości.

£pni.ewąż takie postępowanie może być zastosowane w.stosunku do niewielkiej liczby białek, przyjęło się w praktyce korzystanie z metod fizykochemicznych do określenia masy biopolimerów. Największe zastosowanie znalazły pomiary ciśnienia osmotycznego, szybkości sedymentacji, dyfuzji i lepkości. Stosuje się również chromatografię i elektroforezę oraz mikroskopię elektronową.

Duże znaczenie ma .metoda wyznaczania masy „cząsteczkowej białek przez określenie szybkości, sedymentacji. W dużym polu grawitacyjnym, wytworzonym w ultrawirówce (najczęściej ok. 70 (XX) obr/min ok. 500 000 g) cząsteczki białek sedymentują z różną prędkością w zależności od wielkości i masy. Przy dużych obrotach szybkość sedymentacji jest znacznie większa od szybkości dyfuzji. Wędrujące cząsteczki tworzą wyraźną granicę na pewnej wysokości rozpuszczalnika, a szybkość przesuwania tej granicy rejestruje się fotograficznie o odstępach czasu t. Szybkość sedymentacji określa się współczynnikiem sedymentacji S. Dotychczas jednostką stałej sedymentacji był 1 svedberg (1 S), równy 10"'³ sekundy. Obecnie stałą sedymentacji wyraża się w podwielokrotnościach sekundy, najczęściej w pikosekundach (1 S = 0,1 ps).

Prostym, szybkim i powszechnie stosowanym sposobem oznaczania mas cząsteczkowych białek jest metoda sączenia molekularnego (filtracji żelowej). Po zmierzeniu objętości eluatu (wymywanie) różnych

/•* ' -    -■'•'■?' '?y /»■ ^ j*

związków o ściśle określonych masach cząsteczkowych i wyznaczeniu

zależności między masą cząsteczkową wzorcowych białek i ich objętościami możliwe jest określenie masy cząsteczkowej badanego związku wyznaczając doświadczalnie jego objętość.

2.8.2. Właściwości amfoteryczne białek

Natywne białka globularne zachowują się w roztworze jak kwasy lub zasady, a ta ich właściwość uwarunkowana jest przede wszystkim stosunkowo dużą liczbą jonizujących grup reszt aminokwasowych.Jjiąn elektryczny cząsteczkj białka zależy więc od phLśrodowiska-.W-ścodpwisku kwaśnym, na skutek , nadmiaru jonów__woflo.rowych, dyspcjacja grup kwasowych cofa się, a cząsteczka _.białkQwa__jest kationem. Natomiast w. środowisku zasadowym, gdy_.gaipy-zasadow.e 'tracą ładunek elektryczny, cząsteczka białka jest anionem.

białko* < * H⁺ = ⁺białko" ^ ^> H⁺ + białko’

forma kationowa    jon obojnaczy    forma anionowa

W białkach mamy, yyięc—do czynienia , z.. dysocjacją, „kwasową _i. zasadową, przy. czym stopień .dysocj.aęji i liczba ładunków „zależą od rodzaju aminokwasów^ zawartych w danej cząsteczce . białkowej i odę.zynu środowiska.. Możliwe jest więc osiągnięcie takiego odczynu środowiska, w któiym następuje zrównoważenie ładunków dodątnj_ch_j ujemnych w cząsteczce białka. Takie stężenie jonów wodoroyyych, przy którym cząsteczka białka staje się jonem obojnaczym, nazywa się punktem izoelektrycznym.

Tabela 8

Punkty izoelektryczne różnych białek

Białko	PH	Białko	pH
Pepsyna	< 1.1	Laktoglobulina	5,2
Albumina jaja	4,6	Hemoglobina	6,8
Kazeina	4,7	Mioglobina	7,0
Żelatyna	4,9	Protamina	12,0

Punkt izoelektryczny białek jest wielkością charakterystyczną. _W punkcie tym wartość .ładunku elektrycznego białką„.,^jr.az jego