DSC00158 (22)

Identyfikację aminokwasów można przeprowadzić albo przez określenie współczynnika R_f/ albo przez porównanie rozdziału badanej mieszaniny z równolegle wykonanym rozdziałem wzorców. Wiadomo też, że aminokwasy dikarboksylowe i diaminowe lub z grupą -OH mają większe powinowactwo wobec fazy wodnej stacjonarnej i oznaczają się tym samym mniejszą ruchliwością. Aminokwasy z niepodstawionym łańcuchem hydrofobowym posiadają większe powinowactwo do fazy ruchomej, czyli wobec rozpuszczalników organicznych. Stąd na chromatogramie bibułowym droga wędrówki na przykład kwasu glutaminowego jest krótsza niż aminokwasów obojętnych. Wśród aminokwasów z niepodstawionym i łańcuchami powinowactwo wzrasta ze wzrostem hydrofobowości. Ruchliwość waliny czy leucyny jest większa niż glicyny lub alaniny.

' 3.1. Rozdział mieszaniny aminokwasów techniką Matthiasa Odczynniki

układ rozwijający: n-butanol, kwas octowy i woda w stosunku objętościowym 4:1:1 bibuła Whatmana 3 lub 4

wywoływacz ninhydrynowy: 300 cm³ metanolu + 175 cm³ n-butanolu + 15 cm³ mol/! kwasu octowego 1 500 mg ninhydryny 0,1% aminokwasy wzorcowe w 0,1 mol/l HCl: cysteiny, glicyny, alaniny, waliny, leucyny i izoleucyny badany aminokwas w roztworze

Sprzęt

komora chromatograficzna

mikropipety

suszarka

cieplarka

rozpylacz

nożyczki, ołówek

Wykonanie

Z arkusza bibuły Whatmana 3 lub 4 wyciąć paski o wymiarach przedstawionych na rysunku obok.

Nanoszenie próby

-3 cm

Za pomocą mikropipety nanosi się w środku paska bibuły, tuż przed zwężeniem, małą kroplę o objętości 5 p.1 badanego aminokwasu. Miejsce nanoszenia zaznaczyć najpierw ołówkiem. Jej wielkość nie powinna przekroczyć 3 mm. Na drugim pasku nanieść mieszaniny aminokwasów wzorcowych. Chromatogramy z naniesionymi plamkami aminokwasów suszy się i umieszcza w komorze chromatograficznej.

Rozwijanie chromatografów

e

u

miejsca

naniesienia

Na dnie komory chromatograficznej w specjalnej rynience układu rozwijającego umieszczamy paski Matthiasa w taki sposób, aby rozszerzony koniec paska był zanurzony w cieczy, ale miejsce naniesienia aminokwasów musi znajdować się nad powierzchnią układu rozwijającego. Komorę szczelnie się zamyka aby nastąpiło wysycenie parami rozpuszczalnika. Po 2—3 godzinach, gdy front rozpuszczalnika dotrze prawie do końca paska bibuły, chromatogramy wyjmuje się i zaznacza ołów-

Pasek bibuły do chromatografii wykonanej techniką Matthiasa

Rozwijanie chromatogramów w komorze techniką Matthiasa

Schemat wywołanego chromato-gramu wzorcowych aminokwasów