laboratorium przemysłowe
dr inż. Paweł Satora
Katedra Technologii Fermentacji
i Mikrobiologii Technicznej
Akademia Rolnicza w Krakowie
Escherichia coli
Charakterystyka i wykrywanie w żywności  cz. II
Streszczenie Summary
Dwuczęściowy artykuł poświęcony jest ogólnej charakterystyce This two-part article presents the general characteristics of
bakterii Escherichia coli, a także metodom jej wykrywania w żyw- a bacterium Escherichia coli, as well as the methods for its de-
ności. W pierwszej części omówione zostały właściwości bioche- tection in food. In the first part, the biochemical properties of this
miczne tego mikroorganizmu na tle innych przedstawicieli rodziny microorganism compared with other Enterobacteriaceae bacteria
Enterobacteriaceae, a także podział szczepów chorobotwórczych were discussed, the division of E. coli pathogenic strains for the
ze względu na mechanizm ich oddziaływania na organizm człowie- sake of the mechanism of pathogenicity and virulence factors was
ka. Druga część obejmuje obecnie stosowane metody detekcji tych showed. The second part includes currently applied methods for
bakterii, a także zasięg występowania patogenów w żywności. E. coli detection and the range of occurrence in food.
SÅ‚owa kluczowe Key words
Escherichia coli, serotyp O157, EHEC, podłoża chromogenne Escherichia coli, serotype O157, EHEC, chromogenic media
Wykrywanie i identyfikacja bakterii E. coli ronidazy, który rozkłada MUG, tworząc fluorescencyjny związek.
Normy wykorzystujÄ…ce syntetyczne substraty chromogenne do wy- W rodzinie Enterobacteriaceae jedynymi innymi mikroorganizmami
krywania bakterii z gatunku E. coli wprowadzono po raz pierwszy zdolnymi do syntezy ²-glukuronidazy sÄ… niektóre kultury z rodzaju
w 1990 roku w Stanach Zjednoczonych. Metody te szybko znalazły Salmonella, Shigella oraz Yersinia. Właściwości do rozkładu MUG
swoje zastosowanie również w innych krajach. Procedury obejmowały mogą dodatkowo również posiadać przedstawiciele innych rodzin
użycie dwóch aktywnych substratów: o-nitrofenylo-²-D-galaktopirano- bakteryjnych, jak np. szczepy Staphylococcus. Ponieważ zastosowanie
zydu (ONPG) oraz 4-metyloumbeliferylo-²-D-glukuronianu (MUG). wyżej wymienionych substratów jest skutecznÄ… metodÄ… wykrywania
Większość szczepów pałeczki okrężnicy (podobnie jak inne bakterie bakterii E. coli, a oprócz tego odznaczają się dużą szybkością i czuło-
z grupy coli) wytwarza enzym ²-galaktozydazÄ™, który hydrolizuje Å›ciÄ…, liczne firmy rozpoczęły produkcjÄ™ podÅ‚oży zawierajÄ…ce ONPG
ONPG, w wyniku czego uwalniają się żółty o-nitrofenol oraz galak- i MUG lub ich pochodne. Przykładem mogą być pożywki do testu
toza. Jednocześnie bakterie E. coli (przyjmuje się, że 97% wszystkich Colilert (Environetics), LST-MUG (Hach), Colitrack-plus (BioControl
szczepów) charakteryzujÄ… siÄ™ aktywnoÅ›ciÄ… innego enzymu ²-gluku- Systems), LMX (Merck) i inne.
Laboratorium | 12/2007
26
fot. Shutterstock
laboratorium przemysłowe
Hydroliza z udziaÅ‚em ²-glukuronidazy wykorzystana zostaÅ‚a również
w nowszych podłożach zawierających inny substrat chromogenny,
tzw. X-Glu, czyli 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-²-D-glukopiranozyd. Pod
wpływem enzymu rozkłada się on do 5-bromo-4-chloro-hydroksyindolu
oraz glukozy, z których ten pierwszy ulega dalej przekształceniom
w niebieski barwnik  pochodną indygo. X-Glu stanowi składową agaru
chromogennego TBX, wykorzystywanego w horyzontalnej metodzie
oznaczania liczby ²-glukuronidazo-dodatnich bakterii E. coli (PN-ISO
16649:2004).
W przypadku mniej specyficznych oznaczeń (NPL) wykorzystuje się
podłoża niezawierające w swoim składzie chromogenów. Przykładem
może być norma PN-ISO 7251:2006, zgodnie z którą do oznaczeń
wykorzystuje się bulion EC. W swoim składzie zawiera on laktozę
promującą wzrost jedynie laktozododatnich bakterii, zwłaszcza bakte-
rii z grupy coli, w tym E. coli. Równocześnie sole żółciowe eliminują
z posiewu bakterie Gram-dodatnie oraz te mikroorganizmy, które nie
sÄ… przystosowane do wzrostu w warunkach panujÄ…cych w jelitach.
Wynikiem pozytywnym oznaczeń jest pojawienie się gazu powstają-
cego w wyniku metabolizowania laktozy. Oznaczenie przeprowadza
siÄ™ w dwóch temperaturach 35°C i 44,5°C, przy czym w obu rozwijać
się mogą głównie komórki E. coli. Analiza potwierdzona może zostać
testem na zdolność do tworzenia indolu.
Serotypy E. coli O157 wykazują większość typowych cech dla gatunku
E. coli, w przeciwieństwie do pozostałych serotypów nie fermentują
jednak sorbitolu w ciągu 24 godzin. Cecha ta została wykorzystana
w normie PN-EN ISO 16654:2002. Analizy opisujÄ…ce wykrywanie
serotypu O157 w żywności i paszach są kilkuetapowe. Początkowo
bakterie z testowanej próbki namnaża się przez 6-8 godzin w bulionie
tryptonowo-sojowym wzbogaconym w nowobiocynÄ™  antybiotyk
działający głównie na bakterie Gram-dodatnie. Następnie z zawiesiny
wychwytuje się komórki E. coli O157 przy użyciu cząstek magne-
tycznych spłaszczonych przeciwciałami przeciw temu serotypowi
i separatora magnetycznego. W trzecim etapie wyosobnione bakterie
przepłukuje się odpowiednim buforem, zawiesza w nim, a uzyskaną
zawiesinę wysiewa na dwie agarowe pożywki selektywne. Norma zaleca
stosowanie podłoża McConkeya z sorbitolem (SMAC) i dodatkowymi
czynnikami selektywnymi  cefiksimem i tellurynem potasu. Substancje
te ograniczajÄ… wzrost mikroflory (Proteus, Providencia, Morganella),
która wykazuje brak zdolności do fermentacji sorbitolu, podobnie
Laboratorium | 12/2007
27
27
fot. Shutterstock
laboratorium przemysłowe
Pożywka Zastosowanie Charakterystyka wzrostu Skład
Pożywka do wykrywania i oznaczania liczby
Agar bakterii Escherichia coli w żywności, paszy E. coli  małe kolonie, jasnoniebieskie lub niebieskozielone
chromogenny i wodzie. Wzrost towarzyszącej mikroflory Gram- Citrobacter freundii  małe bezbarwne kolonie
Pepton, sole żółciowe, X-Glu, agar
TBX -dodatniej jest hamowany dzięki zastosowaniu Enterobacter aerogenes  małe bezbarwne kolonie
(Merck) wysokiej temperatury inkubacji 44°C, wstÄ™pna Staphylococcus aureus  brak wzrostu
inkubacja 37°C lub 30°C.
Pożywka przeznaczona do jednoczesnego
E. coli  zmiana barwy na zielononiebieskÄ…, fluorescencja w UV Tryptoza, chlorek sodu, sorbitol,
wykrywania E. coli i pałeczek z grupy coli
(336 nm), obecność indolu (odczynnik Kovacsa) tryptofan, K2HPO4, KH2PO4, sól
Bulion LMX poprzez wykorzystanie specyficznego
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter sodowa siarczanu laurylu, X-Gal,
(Merck) dziaÅ‚ania ²-galaktozydazy (grupa coli) oraz
freundii  zmiana barwy na zielononiebieskÄ…, brak fluorescencji MUG, 1-izopropylo-²-D-1-tio-
²-glukuronidazy i tryptofanazy (E. coli)
Shigella flexneri  brak zmiany zabarwienia galaktopiranozyd
w żywności metodą NPL.
Test wykorzystuje się do wykrywania bakterii E. coli  barwa żółta i fluorescencja
Odczynnik Colilert zawierajÄ…cy
Test Colilert grupy coli i E. coli wskaz
nikowe substraty K. pneumoniae  barwa żółta i brak fluorescencji
OPNG, MUG
odżywcze ONPG i MUG. Pseudomonas aeruginosa  brak barwy i fluorescencji
Wybiórcze podłoże z zawartością bio-Gelytone, ekstrakt drożdżowy,
E. coli  kolonie różowo-fioletowe, 0,5-2,0 mm
chromogenów służące do wykrywania, oceny chlorek sodu, sole żółciowe,
COLI ID Inne pałeczki coli  kolonie niebieskoszare, 0,5-2,0 mm
iloÅ›ciowej i różnicowania ²-D-glukuronidazo mieszanina aktywatorów
(bioMerieux) Inne bakterie Gram-ujemne  kolonie bezbarwne, 0,1-1,0 mm
pozytywnych pałeczek E. coli. i substratów chromogennych, agar
Tabela 1. Wybrane podłoża i testy stosowane w celu wykrycia i ilościowego oznaczenia bakterii E. coli
Przybliżony
Technika badawcza Przeznaczenie testu Nazwa testu Dostawca
czas badania [h]
E. coli O157
25 bioMerieux UK Ltd.
E. coli O157 Vidas E. coli O157
18 Organon Teknika Ltd.
Test immunoenzymatyczny EHEC  Tek Incorporating Immunocapture Beads
(ELISA) E. coli O157 Petrifilm  HEC
28 3M Healthcare Ltd.
E. coli O157:H7 E. coli O157:H7 Visual Assay
28 TECRA Diagnostics UK
E. coli O157:H7 24 Neogen Corp.
E. coli O157:H7 Reveal dla E. coli O157:H7 8 Neogen Corp.
Immunochromatografia
E. coli O157:H7 Reveal 8 dla E. coli O157:H7 24 Bio Control Systems Inc.
(IC)  chromatografia na
VIP (Visual Immunoprecipitate Assay) dla EHEC
immobilizowanych białkach
E. coli O157:H7 EIAFOSS E. coli O157 Pathstik 26 Foss Electric
E. coli O157:H7 48 Celsis Ltd.
E. coli O157
BAXTM dla E. coli O157 24 Qualicon
Reakcja łańcuchowa E. coli O157:H7
PROBELLATM 24 Sanofi Diagnostics, Pasteur
polimerazy
(PCR) E. coli O157:H7
TaqMan® E. coli O157:H7 detection kit 24 PE Biosystems
Tabela 2. Wybrane metody służące do wykrywania i identyfikacji serotypu E. coli O157 w żywności
Limit w 1 g
Środek spożywczy n c
mM
1. Produkty mięsne i drobiowe 52 102 103
(wędliny inne niż surowe i surowe parzone,
przetwory mięsne paczkowane, plasterkowane lub porcjowane)
2. Produkty owocowe, warzywne i owocowo-warzywne
a. owoce mrożone 5 2 102 5x102
b. owoce homogenizowane mrożone
w opakowaniach niehermetycznych 5 2 102 5x102
c. owoce suszone i nasiona Å‚uskane 5 2 102 5x102
d. świeże lub blanszowane, chłodzone lub mrożone kiełki,
surówki warzywne do bezpośredniego spożycia 5 2 102 5x102
e. przyprawy, zioła przyprawowe w całości i rozdrobnione,
suszone oraz mieszanki przyprawowe 5 1 103 104
3. Wyroby garmażeryjne
(wyroby garmażeryjne i potrawy kulinarne gotowe (mięsne lub niemięsne, 52 102 103
podrobowe i galarety), sosy zimne, sałatki, majonez)
4. Przetwory zbożowe, pieczywo, makarony, wyroby ciastkarskie 5 2 102 103
5. Tłuszcze roślinne i mieszane, margaryna 5 2 102 103
6. Wyroby cukiernicze
sosy deserowe utrwalone (karmelowe, toffi, kakaowe itp.) 52 102 103
i polewy cukiernicze do lodów
7. Preparaty enzymatyczne 5 0 0 (25g) -
8. Środki spożywcze specjalnego przeznaczenia żywieniowego 5 0 0 -
a. produkty instant dla niemowląt i małych dzieci do lat 3
b. herbatki instant owocowe lub ziołowe 5 1 10 102
9. Suplementy diety 5 0 0 -
Tabela 3. Maksymalne poziomy zanieczyszczeń E. coli w wybranych produktach żywnościowych
Laboratorium | 12/2007
28
laboratorium przemysłowe
jak E. coli O157, i mogą zafałszować wynik oznaczenia. Na podłożu 4. Czajkowska D.: Escherichia coli O157:H7  chorobotwórczość i wykrywa-
SMAC sorbitolo-dodatnie bakterie tworzą kolonie lekko czerwona- nie w produktach spożywczych. Materiały z Seminarium  Współczesne
we, natomiast sorbitolo-ujemne  jasnoróżowe. Drugie z podłoży zagrożenia mikrobiologiczne w żywności na wszystkich etapach
pozostawia się do wyboru laboratorium. Ponieważ proces separacji produkcji i obrotu , Warszawa  Miedzeszyn, 21-22 kwietnia
immunomagnetycznej nie gwarantuje otrzymania jedynie bakterii 2005.
serotypu O157, podejrzane kolonie przeszczepia się na agar odżywczy 5. Doyle M.P., Schoeni J.L.: Isolation of Escherichia coli O157:H7 from
w celu uzyskania czystej kultury i wykonuje badania potwierdzajÄ…ce, retail fresh meats and poultry.  Applied and Environmental Micro-
obejmujące określenie zdolności wytwarzania indolu, oraz badania biology , 1987, 53 (10), 2394-2396.
serologiczne  aglutynacjÄ™ z surowicÄ… anty-E. coli O157. 6. Geissler K., Manafi M., Amoros I., Alonso J.L.: Quantitative deter-
W wykrywaniu chorobotwórczych szczepów E. coli zastosowanie mination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with
znalazły również nowoczesne metody molekularne, takie jak testy chromogenic and fluorogenic media.  Journal of Applied Microbiolo-
immunoenzymatyczne (ELISA), immunochromatografia oraz reakcja gy , 2000, 88, 280-285.
łańcuchowa polimerazy (PCR) (tabela 2). 7. Manafi M.: New developments in chromogenic and fluorogenic culture
media.  Interantional Journal of Food Microbiology , 2000, 60,
Znaczenie E. coli w żywności 205-218.
Szczepy niepatogenne E. coli ze względu na swoje właściwości oraz 8. PN-ISO 16649-2:2004 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna
zdolność do przeprowadzania fermentacji pseudomlekowej mogÄ… metoda oznaczania liczby ß-glukuronidazo-dodatnich Escherichia
przyczyniać siÄ™ do psucia różnych artykułów żywnoÅ›ciowych. coli. Część 2: Metoda pÅ‚ytkowa w temperaturze 44°C z zastosowa-
WystÄ™powanie tych mikroorganizmów wraz z bakteriami wÅ‚aÅ›ciwej niem 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-ß-D-glukuronidu.
fermentacji mlekowej podczas fermentacji surowców roślinnych 9. PN-EN ISO 16654:2002 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzon-
(np. kiszenie kapusty i ogórków) powoduje obniżenie końcowej talna metoda wykrywania Escherichia coli O157.
jakości produktu. Pałeczka okrężnicy może również wywoływać 10. PN-ISO 7251:2006 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna
różne wady mleka (oborowy smak i zapach, porozrywany skrzep), metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby przypuszczalnych
masła (gorzki smak, oborowy zapach) oraz wczesne wzdęcia serów. Escherichia coli  Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby.
Ponadto bakterie te mogą zakłócać prawidłowy przebieg różnych 11. Venkateswaran K., Murakoshi A., Satake M.: Comparison of commer-
innych procesów fermentacyjnych. cially available kits with standard methods for the detection of coliforms
Kałowe z
ródła skażenia żywności wciąż są istotnym czynnikiem and Escherichia coli in foods.  Appl. Environ. Microbiol. , 1996, 62,
wpływającym na wybuchy infekcji związanych z E. coli, a zwłaszcza 7, 2236-2243.
z EHEC. Grupy żywności kojarzone ze zwiększonym ryzykiem infekcji
powodowanych przez chorobotwórczą pałeczkę okrężnicy można
ogólnie podzielić na cztery grupy:
 surowce lub produkty narażone na zanieczyszczenie pochodzące
z jelita grubego (np. mięso),
 produkty wytworzone z pominięciem etapu przetworzenia mogą-
cego zniszczyć drobnoustroje (np. gotowanie),
 produkty narażone na zanieczyszczenia po przetworzeniu,
 zanieczyszczone produkty sprzedawane jako gotowe do spożycia.
Przyczynami zatruć pokarmowych wywoływanych przez E. coli
były jak dotąd głównie hamburgery, mięso drobiowe, hot dogi,
fermentowane wędliny, surowe mleko i sery otrzymywane z surowe-
go mleka, jogurt, niepasteryzowane soki owocowe, cydr jabłkowy,
sałata liściasta, różnego typu surówki, majonez i sosy na bazie
majonezu oraz kiełki roślinne. Maksymalne dopuszczalne poziomy
zanieczyszczeń E. coli w wybranych produktach żywnościowych
przedstawia tabela 3.
Piśmiennictwo
1. Bell C., Kyrkiades A.: Pathogenic Escherichia coli [w:] Blackburn C.W.,
McClure P.J.: Foodborne pathogens. Hazards, risk analysis and control.
CRC Press, Cambridge 2002.
2. Betts G.D., Lyndon G., Brooks J.: Heat resistance of emerging foodborne
pathogens: Aeromonas hydrophila, Escherichia coli O157:H7, Plesiomonas
shigelloides and Yersinia enterocolitica. Campden Food & Drink Rese-
arch Association, Technical Memorandum nr 672, 1993, Chipping
Campden.
3. Bolton F.J., Crozier L., Williamson J.K.: Isolation of Escherichia coli
O157 from raw meat products.  Letters in Applied Microbiology ,
1996, 23, 317-321.
Laboratorium | 12/2007
29
29