enzymy5

- Wprowadzenie do enzymów 99

:ela 1. Międzynarodowa klasyfikacja enzymów

Nazwa	Typ katalizowanej reakcji		Przykład
Oksydo- reduktazy	przenoszenie elektronów	A + B -» A + B	dehydrogenaza alkoholowa
Transferazy	przenoszenie grup funkcyjnych	A-B + C -» A + B-C	heksokinaza
Hydrolazy	reakcje hydrolizy	A-B + H20 -> A-H + B-OH	trypsyna
Liazy	rozszczepianie wiązań C-C, C-O,	A-B -> A = B + X-Y	dekarboksylaza
	C-N i innych, często tworzenie podwójnego wiązania	I I X Y	pirogronianowa
Izomerazy	przenoszenie grup w obrębie	A-B -»A-B	izomeraza
	cząsteczki	I I I I X Y Y X	maleinianowa
Ligazy	tworzenie wiązań sprzężone	A + B -> A-B	karboksylaza
(syntetazy)	z hydrolizą ATP		pirogronianowa

ków optimum takie przypada zazwyczaj na 25-37°C. Istotne jest również, aby mierzona szybkość reakq‘i stanowiła miarę badanej aktywności enzymatycznej i nie była ograniczona niedostatecznym dopływem substratu. Dlatego też zwykle są konieczne duże stężenia substratu tak, aby początkowa szybkość reakcji, którą właśnie mierzy się doświadczalnie, była proporcjonalna do stężenia enzymu (patrz temat C3).

Zazwyczaj enzym oznacza się przez pomiar szybkości pojawiania się produktu lub szybkości zużywania substratu. Jeśli substrat (lub produkt) absorbuje światło o specyficznej długości fali, to zmiany stężenia tego związku można mierzyć, śledząc zmianę absorbancji przy tej długości fali. Dokonuje się tego zazwyczaj za pomocą spektrofotometru. Jeśli substrat (lub produkt) wykazuje fluorescencję (patrz temat A4), zmiany jego stężenia, znajdujące wyraz w zmianie fluorescencji, można mierzyć za pomocą fluorymetru. Ponieważ absorbancja (lub fluorescencja) jest w określonym zakresie proporcjonalna do stężenia, szybkość zmiany absorbancji (lub fluorescencji) jest proporcjonalna do aktywności enzymu wyrażonej w molach zużytego substratu (lub wytworzonego produktu) w jednostce czasu.

Cząsteczkami najczęściej używanymi do pomiarów absorbancji w celu oznaczania aktywności enzymów są dwa koenzymy: zredukowany dinu-kleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH) oraz zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH) (patrz niżej), które absorbują w obszarze ultrafioletu (UV) przy 340 nm. Jeśli więc w przebiegu reakcji zostaje wytworzony NADH lub NADPH, nastąpi odpowiedni wzrost absorbanq'i przy 340 nm, a jeśli reakcja polega na utlenianiu NADH do NAD⁺ lub NADPH do NADP⁺, wystąpi odpowiedni spadek absorbancji, ponieważ utlenione formy nie absorbują światła przy 340 nm. Na przykład pomiaru aktywności dehydrogenazy mleczanowej z mleczanem jako substratem można dokonać, śledząc wzrost absorbancji przy 340 nm, zgodnie z następującym równaniem:

CH₃CH(OH)COCT + NAD"

mleczan

-» CH₃COCOCT + NADH + H~ pirogronian