Opracował: Wojciech Augustyniak
Krystalizacja (1)
Oczyszczanie ciał stałych
Krystalizacja z indywidualnego rozpuszczalnika
Wybór rozpuszczalnika:
- duża różnica rozpuszczalności oczyszczanego związku na zimno i na gorąco
- bardzo dobra (gotowanie z substancjÄ… powierzchniowo czynnÄ… i przesÄ…czenie roztworu),
albo bardzo słaba (gorący roztwór należy przesączyć) rozpuszczalność zanieczyszczeń
- bierność chemiczna względem oczyszczanego związku
- temperatura wrzenia niższa od temperatury topnienia oczyszczanego związku
- niepalność, mała toksyczność
Należy stosować możliwie małe ilości rozpuszczalnika
Opracował: Wojciech Augustyniak
Krystalizacja (2)
Chłodzenie szybkie: małe kryształy, więcej zarodkow krystalizacji, sprzyja tworzeniu oleju;
chłodzenie wolne: duże kryształy
Inicjacja krystalizacji:
- silne początkowe chłodzenie i powolne ogrzanie do temperatury otoczenia
- naprzemienne chłodzenie i ogrzewanie
- tarcie o ścianki naczynia
- mieszanie
- zaszczepianie
Krystalizacja z mieszaniny rozpuszczalników:
rozpuszczanie w gorÄ…cym rozpuszczalniku dobrze rozpuszczajÄ…cym zwiÄ…zek, i wytrÄ…canie
rozpuszczalnikiem z
le rozpuszczajÄ…cym zwiÄ…zek
Krystalizacja przez wytrÄ…canie kwasu z roztworu soli, bÄ…dz
soli amoniowej z roztworu aminy
Opracował: Wojciech Augustyniak
Ekstrakcja (1)
Ekstrakcja z materiału stałego (rozdrobnionego):
- prosta
- ciągła (nie osiąga się stanu równowagi; aparat Soxhleta  zatężanie ekstraktu, skroplony
rozpuszczalnik rozpuszcza kolejną porcję ciała stałego)
Ekstrakcja z cieczy:
- nieciągła (prosta K > 5, wielokrotna K ~ 1, frakcjonowanie  ekstrakcja porcji roztworu
substancji tym samym roztworem rozpuszczalnika  K ~ 1)
- ciągła (nie osiąga się stanu równowagi; perforacja  zatężanie ekstraktu i zawrócenie
skroplonego rozpuszczalnika do procesu, K < 1)
Prawo podziału Nernsta (dla danej temperatury i dla liniowej izotermy podziału):
K = a1/a2 H" c1/c2
K  współczynnik podziału
1
1
P = ( )n
E = ( )n " v " K
Ekstrakcja wielokrotna:
v "K +1
v "K +1
E  ilość substancji w n-tym ekstrakcie
P  ilość substancji niewyekstrahowanej
v  stosunek objętości roztworów
Opracował: Wojciech Augustyniak
Ekstrakcja (2)
Dobór rozpuszczalników:
- minimalna wzajemna rozpuszczalność
- bierność chemiczna względem siebie i substancji ekstrahowanych
- duża różnica w rozpuszczalności substancji ekstrahowanych, tj. jeden z rozpuszczalników
musi rozpuszczać obydwie substancje, a drugi jedną z nich; odpowiednie wartości K
- mała lepkość, duże napięcie powierzchniowe (trudniejsze emulgowanie)
- łatwość odzyskania związków z rozpuszczalników
- niska palność
Technika:
- wytrząsanie celem zwiększenia powierzchni kontaktu pomiędzy rozpuszczalnikami
- lepiej ekstrahować więcej razy mniejszymi porcjami rozpuszczalnika, niż mniej razy
większymi porcjami rozpuszczalnika
- efekt solny
- efekt hydrotropowy
- efekt pH
Wykorzystanie możliwości tworzenia soli amin, kwasów i fenoli umożliwia łatwe
przeprowadzanie ich do warstwy wodnej po zakwaszeniu/alkalizacji, a następnie do warstwy
organicznej po alkalizacji/zakwaszeniu
Opracował: Wojciech Augustyniak
Destylacja (1)
Rozdział cieczy
y  ułamek molowy w fazie gazowej
yA p xA
A
Prawo Raoulta:
= " x  ułamek molowy w fazie ciekłej
1- yA pB 1- xA
p  ciśnienie pary nasyconej
Destylacja prosta:
- wybór sposobu ogrzewania zależny od temperatury wrzenia  łaz
nie wodne (do 80oC),
olejowe, płaszcze grzejne
- wybór chłodnicy  chłodnice Liebiega z płaszczem wodnym (do 140oC), lub bez płaszcza;
chłodnica powinna być tym dłuższa, a wylot par do chłodnicy tym wyżej, im mniejsza jest
temperatura wrzenia
- stosowanie kamyków wrzennych celem równomierności ogrzewania całego roztworu
- odpowiednie zamocowanie termometru
- wyrównywanie ciśnienia z otoczenem poprzez otwór za chłodnicą
Destylacja przy stałej objętości służy do zatężania bardzo rozcieńczonych roztworów,
wyjściowa mieszanina jest wkraplana w miarę postępu destylacji
Destylacja w skróconym aparacie dla małych ilości roztworu
Destylacja frakcyjna z kolumną destylacyjną (deflegmatorem) i pionową chłodnicą
zwrotną do rozdziału rozpuszczalników o niewielkiej różnicy temperatur wrzenia
Opracował: Wojciech Augustyniak
Destylacja (2)
Destylacja azeotropowa do usuwania jednego ze składników mieszaniny jako azeotropu, np.
wody z benzenem, toluenem, chloroformem (heteroazeotropy  rozdzielanie siÄ™ warstw
w temperaturze niższej od temperatury wrzenia)
Destylacja z parą wodną (tworzenie azeotropów ujemnych), stosuje się dla związków o masie
cząsteczkowej niższej od 150g/mol i prężności par wyższej od 10mmHg w 100oC; można w ten
sposób destylować substancje stałe oraz związki wrażliwe na wysokie temperatury
mA pA MA
= "
mH O pH O MH O
2 2 2
Destylacja pod zmniejszonym ciśnieniem dla związków o wysokich temperaturach wrzenia
(powyżej 250oC), lub nietrwałych:
- używa się nasadki Claisena umożliwiającej wprowadzenie kapilary
- stosuje siÄ™ kuliste odbieralniki
- pompki wodne służą do generowania próżni
Obliczanie temperatury wrzenia w danym ciśnieniu  równianie Clausiusa-Clapeyrona:
LV
dlnp const
= Ò! logp H" Lv  molowe ciepÅ‚o parowania
2
dT R " T T
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia
Chromatografia  różnica w rozdziale substancji pomiędzy fazę stacjonarną i fazę ruchomą
Techniki chromatograficzne:
- kolumnowa (chromatografia adsorpcyjna, podziałowa, jonowymienna, żelowa, powinowactwa)
- cienkowarstwowa (TLC; chromatografia adsorpcyjna, podziałowa, powinowactwa, elektroforeza)
- bibułowa (chromatografia podziałowa)
- wysokociśnieniowa (HPLC; chromatografia adsorpcyjno-podziałowa, jonowymienna, żelowa)
- gazowa (GC, chromatografia podziałowa)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Rodzaje chromatografii
- adsorpcyjna
- podziałowa (rozpuszczalność)
- jonowymienna:
- rozdział ze względu na wymianę jonów ze złożem zawierającym grupy kwaśne (sulfonowe,
karboksylowe, fosforanowe) w wymieniaczach kationów (kationity), lub zasadowe (aminowe)
w wymieniaczach anionów (anionity) związane ze złożem (np. polistyren, celuloza, Sephadex)
- służy do rozdziału związków jonowych, kwasów i zasad (aminy), szczególnie do aminokwasów,
peptydów, białek i kwasów nukleinowych
- stosuje siÄ™ techniki kolumnowe
- żelowa (sączenie molekularne):
- rozdział ze względu na wielkość związku, małe związki silnie penetrują pory złoża (na ogół
Sephadex, wielkość jego porów (G) decyduje o możliwości rozdzielenia określonych
makromolekuł), dzięki czemu są na nim silniej zatrzymywane
- służy do rozdziału związków wielkocząsteczkowych (białka, kwasy nukleinowe), jak i do ich
odsalania
- stosuje siÄ™ techniki kolumnowe
- powinowactwa (afinitywna):
- specyficzne oddziaływania ligand-receptor, przeciwciało-antygen, enzym-substrat
- służy głównie do wyodrębniania określonego białka z ekstraktów komórkowych
- stosuje siÄ™ techniki kolumnowe i cienkowarstwowe
- elektroforeza (rozdział ze względu szybkość migracji jonów w polu elektrycznym)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia adsorpcyjna
O rozdziale decyduje konkurencja substancji i rozpuszczalnika z fazy ruchomej (ciecz lub  rzadko,
dla rozdziału substancji lotnych  gaz) o wiązanie się do adsorbenta z fazy stacjonarnej (ciało stałe)
Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, HPLC
Adsorbent powinien:
- mieć jak najsilniej rozwiniętą powierzchnię
- składać się z odpowiednio wielkich ziaren (im mniejsze, tym szybciej ustala się równowaga,
ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika) o jednorodnej wielkości
- być bierny chemicznie wobec rozpuszczalnika i substancji rozdzielanych
- być selektywny
Rodzaje adsorbentów:
- polarne, dobrze wiążące związki polarne, aktywność maleje z zawilgoceniem; głównie tlenki i sole
- niepolarne, niezwilżalne, dobrze wiążące związki niepolarne; np. węgiel aktywny
Szereg aktywności adsorbentów pod względem wiązania związków organicznych:
celuloza < skrobia < sacharoza < CaSO4 < silikażel < MgO < Al2O3 < węgiel aktywny
Szereg eluotropowy rozpuszczalników:
heksan < CCl4 < benzen < CHCl3 < (C2H5)2O < CH3COOC2H5 < aceton < C2H5OH < CH3OH
< H2O < CH3COOH < pirydyna
Na ogół stosuje się mieszaniny rozpuszczalników; większa polarność substancji rozwijanej
wymaga większej polarności stosowanego układu na adsorbencie polarnym. Na adsorbencie
niepolarnym szereg eluotropowy należy stosować w odwrotnej kolejności, tzn. im silniejsze
wiązanie substancji ze złożem, tym mniej polarny układ rozwijający należy stosować
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia podziałowa
O rozdziale decyduje podział substancji pomiędzy dwie niemieszające się ciecze
2 warianty: chrom. cieczowo-gazowa (gazowa, GC), lub cieczowo-cieczowa (np. bibułowa)
Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, GC, HPLC
Chromatografia cieczowo-cieczowa:
- układ z normalnymi fazami: faza ruchoma  ciecz organiczna, faza stacjonarna  ciecz
osadzona na nośniku stałym (np. woda na celulozie); metoda dobra do rozdziału substancji
polarnych, np,. aminokwasy, peptydy, sacharydy, nukleotydy
- układ z odwróconymi fazami: faza ruchoma  woda, faza stacjonarna  rozpuszczalnik
organiczny zaadsorbowany na nośniku; metoda stosowana w rozdziale związków niepolarnych
(podobnie, jak chromatografia adsorpcyjna)
Nośnik powinien:
- być obojętny wobec rozpuszczalników i rozdzielanych substancji
- nie wykazywać własności adsorpcyjnych i jonowymiennych
- być zwilżany fazą ruchomą
- składać się z jednorodnych ziaren o odpowiedniej wielkości (im mniejsze, tym lepszy rozdział,
ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika)
Najczęstsze złoża: silikażel, celuloza, skrobia, ziemia okrzemkowa, acetyloceluloza
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia bibułowa
Chromatografia cieczowo-cieczowa (cienkowarstwowa technika chromatografii
podziałowej stosowana głównie do rozdziału aminokwasów, peptydów, sacharydów,
nukleotydów):
- faza ruchoma  homogenna mieszanina rozpuszczalników zawierająca wodę,
stacjonarna  woda zaadsorbowana na bibule
- wykonanie techniką wstępującą (rozpuszczalnik migruje od dolnego końca bibuły
zanurzonego w eluencie) lub zstępujacą (spływową; rozpuszczalnik migruje od
górnego końca bibuły zanurzonego w eluencie)
- detekcja  próba ninhydrynowa na aminokwasy i peptydy, UV na nukleotydy
- Rf nie sÄ… dobrze odtwarzalne
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia gazowa
Chromatografia cieczowo-gazowa (kolumnowa technika chromatografii podziałowej
stosowana do rozdziału i analizy gazów, niskowrzących cieczy, lub łatwo lotnych
substancji stałych):
- faza ruchoma  gaz, stacjonarna  wysokowrzÄ…ca ciecz (olej, smar, glikol polietylenowy)
osadzona na obojętnym nośniku (np. długa kapilara szklana)
- GC wykonuje siÄ™ zwykle w wysokich temperaturach,
- detekcja  katarometr (zmiana przewodnictwa w obecności związku opuszczającego
kolumnÄ™), spektrometr mas (GC MS)
- związki opuszczają kolumnę przy określonych, dobrze odtwarzalnych czasach retencji
- GC to dobre narzędzie analityczne, można też używać GC do celów preparatywnych
- GC pozwala na oznaczanie ilościowe (pomiar powierzchni pod pikiem)
- zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów
- przeprowadzenie w lotne pochodne umożliwia analizę związków nielotnych, np. kwasów
karboksylowych jako estrów trimetylosililowych, aminokwasów jako pochodnych
dabsylowych (jako amidy kwasu 4-(dimetyloamino)-azobenzeno-4 -sulfonowego)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia kolumnowa
Faza ruchoma  ciecz, faza stacjonarna  złoże stałe lub ciecz zaadsorbowana na złożu
wypełniającym kolumnę
Kolumnę wypełnia się zawiesiną złoża (wysokość złoża powinna być co najmniej 10 razy
większa od średnicy kolumny; minimum 25 razy więcej złoża od próbki w chromatografii
adsorpcyjnej, 100 razy w chromatografii podziałowej), nanosi próbkę od góry i eluuje układem
rozwijajÄ…cym zbierajÄ…c frakcje; zwiÄ…zki we frakcjach wykrywa siÄ™ za pomocÄ… chromatografii
cienkowarstwowej
Dobieranie eluentu dla chromatografii adsorpcyjnej: próby za pomocą chromatografii
cienkowarstwowej  różnica Rf rozdzielanych związków powinna być większa niż 0.3,
a jedna z substancji nie powinna mieć Rf wyższego od 0.2
Typowe błędy podczas rozdziału:
- zbyt szeroka kolumna  zbyt duża dyfuzja, nierówny przepływ
- zbyt wąska kolumna lub za małe ziarna lub zbyt mało polarny eluent  za wolny przepływ, dyfuzja
- za mało nośnika lub za grube ziarna  zły rozdział
- mokry eluent, kolumna, nośnik  utrata aktywności nośnika, zły rozdział
- zbyt mało aktywny nośnik  zły rozdział
- złe upakowanie kolumny lub nierówne nałożenie próbki  nierówny rozdział
- zbyt polarny eluent  brak rozdziału
- zbyt szybki przepływ  brak rozdziału, nie ustalają się równowagi międzyfazowe
- zbieranie zbyt dużych frakcji  złe rozdzielenie substancji
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia cienkowarstwowa (1)
Faza ruchoma  ciecz, faza stacjonarna - stałe złoże lub ciecz zaadsorbowana na złożu
nałożonym na płytkę
- technika analityczna, niekiedy preparatywna
- stosowana głównie do sprawdzania czystości związków, kontroli reakcji, analizy wycieków
z kolumny chromatograficznej
- zalety: krótki czas rozwijania, proste metody kontroli, zużycie małych ilości związki (ng)
Rf = (odległość od startu do centrum plamki)/(odległość od startu do czoła rozpuszczalnika)
Rf nie jest dobrze odtwarzalnym parametrem
Dobór układu rozwijającego: tak, aby była wyraz
na różnica pomiędzy Rf analizowanych
związków, i aby związki nie zostawały na miejscu nałożenia plamki, oraz aby nie migrowały
z czołem rozpuszczalnika
Opracował: Wojciech Augustyniak
Chromatografia cienkowarstwowa (2)
1. Przygotowanie płytki: warstwa sorbentu 0.2mm grubości, nanoszenie na odtłuszczoną
płytkę, suszenie
2. Nanoszenie próbki: odparowanie rozpuszczalnika, możliwie małaplamka
3. Rozwijanie płytki w szczelnej kamerze chromatograficznej, stosuje się paski bibuły
celem szybszego nasycenia komory parami rozpuszczalnika
4. Wywołanie chromatogramu: UV, pary jodu (układy nienasycone), ogrzewanie po
zwilżeniu stężonym H2SO4 lub 2% KMnO4, ninhydryna (aminy i aminokwasy)
Techniki:
- kilkukrotne rozwijanie w przypadku niskich Rf
- chromatografia dwukierunkowa (rozwijanie chromatogramu w drugim kierunku
w innym układzie rozpuszczalników) w przypadku podobnych Rf
- klinowa (początkowa część chromatogramu zawęża się ku dołowi) celem zwężenia
plamki
- krążkowa (nakraplanie eluentu na środek plamki) celem określenia przydatności układu
do rozdziału)
Opracował: Wojciech Augustyniak
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
HPLC  high pressure/performance liquid chromatography
Chromatografia adsorpcyjno-podziałowa
Faza ruchoma  ciecz wtłaczana pod wysokim ciśnieniem; faza stacjonarna  gęsto i jednorodnie
upakowana złożem kolumna z metalu, dobrze odpowietrzona
Detekcja: lampa UV, katarometr, spektrometr mas
Wariant analityczny (węższe kolumny) i preparatywny (szersze kolumny)
Zalety: szybki, zautomatyzowany i precyzyjny rozdział związków; łatwe stosowanie
gradientów; powtarzalność czasów retencji; ilościowe oznaczanie związków (pole
powierzchni pod pikiem); zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów
Wada: rozdział małych ilości związków
2 warianty:
- kolumna z normalnymi fazami: polarne złoże (np. krzemionka) i niepolarny rozpuszczalnik 
do rozdziału związków niepolarnych
- kolumna z odwróconymi fazami: niepolarne złoże (np. krzemionka związana
z długołańcuchowymi alkoholami na powierzchni), polarny rozpuszczalnik  do rozdziału
związków polarnych, w tym aminokwasów, peptydów, białek, sacharydów
FPLC  fast protein liquid chromatography: metoda podobna do HPLC, stosuje się niższe
ciśnienia, oraz kolumny typowe dla chromatografii jonowymiennej i sączenia żelowego