Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii  studia II stopnia
Dwiczenie 4 Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
Termin remediacja oznacza oczyszczanie i usuwanie zanieczyszczeo powstałych w wyniku działania przemysłu lub w przypadku
awaryjnym ( np. awaria cysterny, wyciek benzyny, awaria tankowca przewożącego ropę naftową). Słowo bioremediacja składa się
ze słów: remediacja - oznaczająca uleczenie (powrót do stanu wyjściowego) i bio - życie.
Możemy następujące zdefiniowad bioremediację jako proces likwidacji skażeo (okazjonalnych i trwałych) z wykorzystaniem
drobnoustrojów lub (i) roślin. W przypadku wykorzystania do tych celów roślin używa się terminu fitoremediacja.
Dokładna ocena środowiska wodno-gruntowego zarówno pod względem krążenia wód jak i stopnia zanieczyszczenia jest bardzo
istotna i stanowi domenę badao hydrologicznych, które pozwalają określid warunki migracji zanieczyszczeo oraz wybrad
właściwą metodę remediacji. Po wycieku produktów naftowych przechodzą one przez strefę aeracji do warstwy wodonośnej,
ulegając po części adsorpcji na materiale skalnym, glebie, a po części zaś infiltrując aż do osiągnięcia zwierciadła wody
podziemnej lub wody gruntowej. Większośd produktów naftowych (PN) ulega rozkładowi biologicznemu (biodegradacji) za
pomocą bakterii, grzybów, które wykorzystują z
ródło energii, jakimi są produkty naftowe w swoim procesie metabolizmu,
szczególnie w procesach tlenowych.
Metody remediacji:
Fizykochemiczne:
Remediacja termiczna polega na cieplnej obróbce wybranego gruntu
- spalenie w temp. powyżej 1300 K
- podgrzewanie, piroliza do temperatury 900 K, a następnie spalanie gazu pirolitycznego
Remediacja ekstrakcyjna polega na płukaniu gruntu czyli na przeniesieniu zanieczyszczeo PN do medium płuczącego ( woda lub
woda z dodatkiem substancji chemicznych).
Elektroreklamacja
- elektroosmoza  polega na ruchu zanieczyszczonej wody porowej między elektrodami
- elektroforeza  ruch cząstek pod działaniem pola elektrycznego
- elektroliza  ruch jonów lub kompleksów między elektrodami
Metody biologiczne:
Landfarming LF polega na umieszczeniu skażonego gruntu PN w warstwach o grubości O,5- 1,5 m na nieprzepuszczalnym
podłożu wyposażonym w system drenażowy. Następuje biodegradacja aerobowa PN wspomagana dodatkiem tlenu, nutrientów
i wody. Czas trwania LF od 1-3 lat.
Bioreaktory, w reaktorach specjalnej konstrukcji, zachodzÄ… procesy biodegradacji wspomagane mikroorganizmami i
podwyższoną temperaturą. Czas reakcji jest dużo krótszy, 3 doby do miesiąca w zależności od temperatury.
Procesy bioremediacji odbywają się z udziałem: mikroflory bytującej w danym środowisku i mikroflory wprowadzanej w formie
biopreparatów.
Dzięki metodą bioremediacji można usuwad między innymi skażenia spowodowane: węglowodorami ropy naftowej, metanem,
metalami ciężkimi, fosforem, truciznami fosfoorganicznymi, pestycydami, fenolami, chlorkiem dodecylopirydynowym (środek
bakteriostatyczny dodawany do emulsji), zeolitami.
Bioremediacja gleb z ropopochodnych
Od kilkunastu lat praktycznie we wszystkich uprzemysłowionych krajach świata istnieje problem skażenia gruntów ropą naftową
i jej produktami. Zanieczyszczenia te dostają się do gleb głównie w wyniku procesów wydobywczych ropy i jej przerobu w
rafineriach oraz awarii podczas magazynowania paliw. Niektóre węglowodory aromatyczne występujące w ropie (benzen,
toluen, ksylen, fenol) są bardzo szkodliwe dla człowieka, ze względu na toksyczne i kancerogenne działanie. Związki te
charakteryzują się bardzo dużą rozpuszczalnością w wodzie, w związku z czym łatwo przedostają się do wód podziemnych, a
następnie do ujęd wodnych. Zanieczyszczenie gleb produktami ropopochodnymi wpływa niekorzystnie na produkcję roślinną
oraz na jakośd wód powierzchniowych i podziemnych.
Czynniki warunkujące efektywnośd procesów bioremediacyjnych
Efektywnośd bioremediacji gruntów z ropy i jej pochodnych zależy od tempa rozkładu tych zanieczyszczeo przez mikroorganizmy
glebowe, na które mają wpływ takie czynniki jak: budowa chemiczna, stężenie węglowodorów i ich toksycznośd w stosunku do
mikroflory, mikrobiologiczny potencjał gleby (stężenie biomasy, różnorodnośd populacji, aktywnośd enzymów), fizykochemiczne
parametry środowiska (m.in. odczyn, temperatura, zawartośd materii organicznej, wilgotnośd) oraz dostępnośd węglowodorów
dla komórek mikroorganizmów.
Minimalna liczebnośd mikroorganizmów w glebie skażonej produktami ropopochodnymi konieczna dla efektywnej
biorekultywacji wynosi ponad 105 komórek/g s.m. gruntu. W powierzchniowych warstwach gleby, zawierających odpowiedni
stosunek C:N:P występuje od 107 do 109 komórek/g gruntu, z tego od 0,1 do 1,0% stanowią organizmy zdolne do rozkładu
substancji ropopochodnych. W glebach skażonych produktami ropopochodnymi liczba bakterii może zwiększyd się od 100 do
1000 razy.
Większośd metod biologicznego oczyszczania zaolejonych gruntów oparta jest na intensyfikacji procesu poprzez zastosowanie
odpowiednio dobranych i przygotowanych zespołów współdziałających ze sobą mikroorganizmów  biocenoz lub konsorcjów
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii  studia II stopnia
Dwiczenie 4 Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
mikroorganizmów, wyspecjalizowanych w rozkładzie węglowodorów naftowych. Biocenozy te, zwane biopreparatami, zawierają
specjalnie wyselekcjonowane ze środowiska naturalnego określone gatunki drobnoustrojów. Wprowadzane są do gleb jako
zaszczepy biologiczne (inokulum) zawierające ok. 109 komórek/cm3. Takie biopreparaty znacznie wspomagają, a niekiedy
warunkujÄ…, biodegradacjÄ™ zanieczyszczeo.
Właściwości i cechy środowiska w przeważającym stopniu decydują o możliwości przeprowadzenia bioremediacji in situ na
danym terenie, bowiem wpływają na mikrobiologiczną aktywnośd (np. temperatura, wilgotnośd) oraz transport (głównie przez
dyfuzję) zanieczyszczeo do wnętrza komórek drobnoustrojów (np. zawartośd i jakośd materii organicznej). Dostępnośd
węglowodorów naftowych dla komórek mikroorganizmów (biodostępnośd) zależy od różnych czynników fizycznych,
chemicznych i mikrobiologicznych, które wpływają zarówno na transport tych związków, jak i migrację mikroorganizmów w
glebie. Słabo rozpuszczalne węglowodory alifatyczne i aromatyczne z czterema i większą liczbą pierścieni łatwo ulegają adsorpcji
na ziarnach gruntu. Istotną rolę w kierowaniu bakterii w stronę węglowodorów naftowych (i innych zanieczyszczeo), które uległy
sorpcji na cząstkach gleby odgrywa chemotaksja. Do cząstek gleby, głównie materii organicznej i frakcji gliny (posiadają dobrze
rozwiniętą i ujemnie naładowaną powierzchnię), mogą również zostad związane mikroorganizmy o hydrofobowych osłonach
komórkowych. Najlepszą metodą poprawienia transportu węglowodorów naftowych do komórek mikroorganizmów i ich
biodostępności jest użycie środków powierzchniowo czynnych (SPC), które obniżają napięcie powierzchniowe i interfazowe
cieczy oraz emulgują substancje lipofilowe powodując zwiększenie powierzchni wymiany i rozpuszczalności. Liczne
mikroorganizmy degradujące węglowodory naftowe produkują środki powierzchniowo czynne (SPC). W sprzedaży dostępne są
również różnego rodzaju syntetyczne środki powierzchniowo czynne, jednak wiele z nich ma ograniczone zastosowanie w
bioremediacji, ponieważ są zbyt łatwo degradowane przez mikroorganizmy lub działają toksycznie na ich komórki. Korzystniejsze
jest wprowadzanie do zanieczyszczonych gruntów biologicznych SPC ze względu na ich biodegradowalnośd w środowisku i niską
toksycznośd. Jednak wysokie koszty ich produkcji sprawiają, że powszechniej wykorzystuje się syntetyczne SPC. Prawidłowy
przebieg procesu biodegradacji może prowadzid do prawie 100% redukcji zanieczyszczeo w ciągu zaledwie kilku tygodni.
Obecnie usunięcie z gruntów lekkich takich zanieczyszczeo jak paliwo Diesla, benzyna, nafta lotnicza nie stanowi żadnej kwestii.
Problem pojawia się w przypadku bioremediacji gleb (w szczególności ciężkich) z czystej ropy lub frakcji ciężkich.
Szybkośd rozkładu różnorodnych produktów ropopochodnych w powierzchniowych warstwach gruntów zachodzi z prędkością
od 0,02 do ponad 0,4 g/kg gruntu/dobę, średnio od 0,09 do 0,14 g/kg gruntu/dobę. W głębszych warstwach gruntu szybkośd
degradacji maleje z powodu niższego stężenia tlenu oraz mniejszej liczby drobnoustrojów .
Strategie stosowane w procesach bioremediacji
Bioremediację gruntów można przeprowadzad sposobem in situ  w miejscu występowania skażenia lub ex situ  po wybraniu
zanieczyszczonej gleby z danego terenu i umieszczeniu w specjalnie przygotowanym miejscu. Technologia in situ stosowana jest
w przypadku braku możliwości usunięcia skażonej ziemi, na przykład na obszarach przeznaczonych pod budownictwo, dróg,
awarii miejscowych pod rurociągami i instalacjami, skażeo dużych obszarów. Głównymi metodami bioremediacji gleb in situ są:
uprawa gleby, biowentylacja, bioekstrakcja. Technologia ex situ umożliwia skuteczniejsze wykonanie procesowych zabiegów
intensyfikacyjnych bioremediacji skażeo, co prowadzi do skrócenia całkowitego czasu rekultywacji.
Wśród metod oczyszczania ex situ wymienid należy: uprawę gleby, kompostowanie, biostosy i bioreaktory. Wyróżnid można trzy
typy bioremediacji gleb: bioremediacjÄ™ naturalnÄ… , biostymulacjÄ™ i bioaugmentacjÄ™.
W bioremediacji naturalnej wykorzystuje siÄ™ proces naturalnej przeprowadzanej przez mikroorganizmy i wymaga jedynie
prowadzenia regularnego monitorowania stężenia zanieczyszczeo. Najpowszechniej stosowaną metodą bioremediacji gruntów
jest biostymulacja polegająca na stymulowaniu wzrostu i aktywności rodzimych populacji drobnoustrojów (przyspieszaniu
procesów biodegradacji zanieczyszczeo) poprzez dostarczenie im odpowiednich substancji pokarmowych lub/i tlenu. Zdarza się,
że rodzime populacje na danym terenie nie wykazują pożądanej aktywności w degradacji zanieczyszczeo. Jest to spowodowane
toksycznym działaniem związków wchodzących w skład skażenia lub brakiem odpowiedniej ilości i jakości organizmów. W takiej
sytuacji można zastosowad bioaugmentację. Metoda ta polega na wprowadzeniu do środowiska odpowiednich
mikroorganizmów. Mogą to byd wyizolowane ze skażonego gruntu i namnożone szczepy, które wykazują największą aktywnośd
w rozkładzie zanieczyszczeo (reinokulacja), rodzime drobnoustroje o selektywnie wzmocnionych w laboratorium zdolnościach
funkcjonalnych lub mikroorganizmy modyfikowane genetycznie (GMM).
Genetycznie zmodyfikowane mikroorganizmy można wykorzystywad nie tylko do przyspieszenia biodegradacji w skażonej glebie,
ale również do monitorowania obecności wprowadzonych do gruntu bakterii oraz oceny biodostępności zanieczyszczeo
(biosensory) i możliwości ich eliminacji. W pierwszym przypadku bakterie są wyposażone w odpowiedni konstrukt genowy, który
jest łatwo wykrywany. Wówczas gdy biodostępnośd zanieczyszczeo jest warunkiem koniecznym do przeprowadzenia na danym
terenie biologicznego oczyszczania można wykorzystad bakterie zawierające w swoim genomie promotor indukowany przez
związek, którego biodostępnośd jest badana. Promotor ten jest połączony z genem, którego produkt można łatwo obserwowad i
zmierzyd. Najpowszechniej używanymi genami reporterowymi są geny bioluminescencji (luc, lux) oraz gen gfp kodujący zielone
białko fluorescencyjne i jego pochodne.
Praktyczne zastosowanie w bioremediacji gruntów z ropy i jej produktów mogą mied bakterie ze wstawionymi do chromosomu
genami enzymów uczestniczących w rozkładzie węglowodorów naftowych (np. genem tod kodującym dioksygenazę toluenu) czy
chemotaksji (np. NahY kodującym białko uczestniczące w chemotaksji do naftalenu i salicylanu) lub z wprowadzonymi
plazmidami degradacji węglowodorów (np. plazmidem degradacji piranu z Mycobacterium sp.).
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii  studia II stopnia
Dwiczenie 4 Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
Mikroorganizmy rozkładające węglowodory naftowe
Zdolnośd do degradacji i/lub wykorzystywania węglowodorów naftowych wykazuj ą liczne rodzaje bakterii i grzybów, a także
drożdże, niektóre Cyanobacteria i zielone glony. Jednak w bioremediacji gruntów, z wielu względów, wykorzystuje się przede
wszystkim bakterie. Charakteryzują się one wysoką liczebnością, szybkim wzrostem i zdolnością degradacji różnorodnych
zanieczyszczeo. Można je łatwo hodowad oraz poddawad manipulacjom genetycznym. Biologiczne oczyszczanie gleb z
produktów ropopochodnych zachodzi głównie w wyniku działalności bakterii tlenowych, które wykorzystują węglowodory
naftowe jako z
ródło węgla i energii potrzebne do ich wzrostu i rozmnażania. Grzyby mają ograniczone zastosowanie w
bioremediacji, ponieważ transformują węglowodory naftowe najczęściej kometabolicznie, wymagając podstawowego substratu
wzrostu (glukoza lub celuloza), a tempo przeprowadzanej przez nie degradacji jest niskie. Organizmy te nie potrafiÄ… dalej
metabolizowad produktów kooksydacji, dlatego też całkowita mineralizacja zanieczyszczeo ropopochodnych następuje w wyniku
aktywności bakterii. Mikroorganizmy najbardziej aktywne w biodegradacji węglowodorów naftowych: Pseudomonas,
Arthrobacter, Alcaligenes, Corynebacterium, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus, Nocardia i Mycobacterium.
Długołaocuchowe węglowodory (alkany i alkeny) są rozkładane przez wiele gatunków bakterii (z rodzaju Pseudomonas,
Acinetobacter, Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium, Geobacillus), a także liczne drożdże (większośd
gatunków Candida), przy czym ich liczba i intensywnośd degradacji wzrasta wraz z długością łaocucha. Mniej licznie występują w
glebach mikroorganizmy zdolne do biodegradacji cykloalkanów, przy czym zachodzi ona przede wszystkim przy udziale
konsorcjum mikroorganizmów w drodze kometabolizmu. Niskocząsteczkowe (dwu- lub trójpierścieniowe) węglowodory
aromatyczne są degradowane przez wiele bakterii glebowych, a także liczne rodzaje grzybów m.in. Rhizopus, Aspergillus,
Candida, Penicillium, Psilocybe, Smittum. Natomiast zdolnośd rozkładu wysokocząsteczkowych (z 4 i większą liczbą pierścieni)
węglowodorów aromatycznych występuje stosunkowo rzadko u bakterii. Zdolnośd do wzrostu na wysokocząsteczkowych
wielopierścieniowych węglowodorach aromatycznych jest prawdopodobnie szeroko rozpowszechniona w obrębie rodzaju
Mycobacterium.
Mechanizmy biodegradacji węglowodorów ropopochodnych
Najpowszechniejszą drogą tlenowej degradacji n-alkanów jest utlenianie terminalne z udziałem monooksygenazy. Hydroksylacja
przy koocowym węglu w łaocuchu prowadzi do wytworzenia odpowiedniego alkoholu, który jest następnie utleniany do
aldehydów i kwasów tÅ‚uszczowych. Kwasy tÅ‚uszczowe przechodzÄ… proces ²-oksydacji, a powstaÅ‚y w nim acetylo-CoA zostaje
włączony w cykl Krebsa. Alkeny ulegają hydrolizie w miejscu podwójnego wiązania, a następnie są metabolizowane jak alkany.
Krótkołaocuchowe węglowodory są trudniej degradowane z wyjątkiem metanu, który w warunkach tlenowych jest szybko
wykorzystywany jako jedyne z
ródło węgla przez metanotroficzne bakterie (np. Methylomonas methanica) i drożdże. Degradację
cykloheksanu zapoczątkowuje hydroksylacja prowadząca do powstania cykloheksanolu, który przekształcany jest w
cykloheksanon i kaprolakton. Następnie hydrolaza laktozowa otwiera pierścieo i powstaje odpowiedni kwas organiczny  kwas
adypinowy. Bakterie i grzyby wykorzystują odmienne drogi w tlenowej biodegradacji węglowodorów aromatycznych. U bakterii
początkowe utlenienie pierścienia katalizowane jest przez wieloskładnikową dioksygenazę. Powstały cis-dihydrodiol ulega re
aromatyzacji (udział dehydrogenazy cis-dihydrodiolu) do pochodnych dihydroksylowych. Dalsze utlenianie prowadzi do
utworzenia katecholu (1,2-dihydroksybenzen) lub kwasu protokatechowego (3,4-dihydroksybenzoesan). Potem następuje
oksydacyjne otwarcie pierścienia aromatycznego (w pozycji orto lub meta) katecholu lub kwasu protokatecholowego z udziałem
dioksygenaz. Dalszy rozkład prowadzi do powstania intermediatów centralnych szlaków metabolicznych, takich jak bursztynian,
acetylo-CoA, pirogronian.
Grzyby nieligninolityczne oraz ligninolityczne utleniają pierścieo aromatyczny do tlenków arenu za pomocą monooksygenazy
cytochromu P-450. Tlenki mogą następnie izomeryzowad do fenoli lub ulec enzymatycznej hydroksylacji katalizowanej przez
hydrolazę epoksydową z wytworzeniem trans-dihydrodioli. W przeciwieostwie do grzybów nieligninolitycznych, z których
stosunkowo niewiele ma zdolnośd degradowania WWA do CO2, systemy enzymatyczne grzybów ligninolitycznych potrafią ciąd i
mineralizowad pierścieo aromatyczny. Posiadają one silne zewnątrzkomórkowe enzymy odpowiedzialne za degradację ligniny,
które działają na szeroką gamę WWA. Znane są, jak dotąd, dwie drogi beztlenowej degradacji alkanów. Pierwsza z nich polega na
addycji fumaranu, druga zaś obejmuje karboksylację i usunięcie terminalnej dwuwęglowej jednostki, co prowadzi do powstania
odpowiedniego kwasu tłuszczowego. Na podstawie dotychczasowych badao wskazuje się na trzy możliwe mechanizmy
początkowej aktywacji pierścienia benzenu, takich jak: karboksylacja, hydroksylacja i metylacja. Pierścieo ulega przekształceniu
do centralnego intermediatu  benzylo-CoA, który jest redukowany do 1,5-dien-1-karboksylo-CoA przez główny enzym 
reduktazÄ™ benzoilo-CoA.
Ekstrakcja (z łaciny: extraho = wyciągam) jest to metoda wyodrębniania z mieszaniny ciał stałych lub cieczy jakiegoś składnika
przy pomocy rozpuszczalnika tak dobranego, aby rozpuszczał przede wszystkim żądany związek. Chemicy stosują tę metodę do
otrzymania związków naturalnych z materiału roślinnego (liści, kory itp.). Wszyscy korzystamy z tej metody np. przy parzeniu
kawy. W syntezie organicznej produkt reakcji otrzymywany jest często wraz z innymi związkami w postaci roztworu lub zawiesiny
w wodzie. Podczas wytrzÄ…sania takiej mieszaniny z nie mieszajÄ…cym siÄ™ z wodÄ… rozpuszczalnikiem, produkt reakcji ulega
ekstrakcji i może byd następnie odzyskany przez odparowanie rozpuszczalnika. Ekstrakcja związku z jednej fazy ciekłej do drugiej
jest procesem ustalania się równowagi zależnym od rozpuszczalności związku w obu rozpuszczalnikach. Stosunek stężenia w
jednym rozpuszczalniku do stężenia w drugim nosi nazwę współczynnika podziału i jest wielkością stałą w danej temperaturze,
charakterystyczną dla danej substancji i określonej pary rozpuszczalników.
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii  studia II stopnia
Dwiczenie 4 Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
Prawo to zwane prawem Nernsta wyraża się następującym wzorem:
gdzie: cA i cB stanowią stężenia substancji w warstwach A i B,
K  współczynnik podziału
Można przyjąd, że w przybliżeniu współczynnik podziału jest równy stosunkowi rozpuszczalności danej substancji w obu
rozpuszczalnikach. Związki organiczne są zwykle lepiej rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych niż w wodzie i dlatego
mogą one byd ekstrahowane z roztworów wodnych. Jeśli do roztworu wodnego doda się elektrolitu, np. chlorku sodu, to
rozpuszczalnośd substancji organicznej maleje, inaczej mówiąc, substancja ulega wysalaniu. Czynnik ten pomaga wyekstrahowad
zwiÄ…zek organiczny.
Stosowane techniki ekstrakcji próbek stałych cieczą dzielą się na trzy zasadnicze grupy:
- Techniki klasyczne, do których zaliczamy: ekstrakcję rozpuszczalnikiem z wytrząsaniem, ekstrakcję za pomocą strumienia
rozpuszczalnika, saponifikację, ekstrakcję w aparacie Soxhleta oraz homogenizację próbki z rozpuszczalnikiem;
- Nowoczesne techniki z wykorzystaniem dodatkowych czynników do wspomagania ekstrakcji (ultradz
więki czy promieniowanie
mikrofalowe). Do tej grupy technik ekstrakcji należy sonikacja, przyśpieszona ekstrakcja z pomocą rozpuszczalnika (ASE),
ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika pod zwiększonym ciśnieniem ((MPLE), ekstrakcja z pomocą rozpuszczalnika wspomagana
promieniowaniem mikrofalowym (MAE);
- Techniki, w których wykorzystuje się płyny w stanie nadkrytycznym (SFE).
Techniki klasyczne
Do ekstrakcji i rozdzielania warstw nie mieszających się ze sobą cieczy używa się rozdzielaczy. Rozdzielacz umieszcza się na
dogodnej wysokości w kółku na statywie. Przed użyciem zawsze należy sprawdzid, czy kran obraca się swobodnie. Wszystkie
szlifowane powierzchnie smaruje się bardzo cienką warstwą specjalnego smaru. Rozdzielacza nie można napełniad więcej niż do
ok. 3/4 wysokości. Należy sprawdzid, czy dolny kran jest zamknięty, a następnie wlewad, najlepiej przez lejek, roztwór wodny i
pierwszą częśd rozpuszczalnika. Podczas wytrząsania rozdzielacz trzyma się kranem do góry, przytrzymując kran jedną ręką, a
korek drugą. Natychmiast po odwróceniu rozdzielacza należy otworzyd kran w celu wyrównania ciśnienia i usunięcia powietrza.
Po krótkim czasie ostrożnego wytrząsania i kilkakrotnym otwarciu kranu należy wytrząsad energicznie przez 2-3 minut. Następnie
rozdzielacz należy umieścid ponownie w kółku i pozostawid, aż warstwy dokładnie się rozdzielą. Wtedy dolną warstwę wylewa
się po otwarciu dolnego kranu do kolby stożkowej. Do ekstrakcji roztworów wodnych używa się rozpuszczalników o mniejszej
gęstości (np. eter dietylowy) lub większej gęstości niż
woda (np. chloroform lub chlorek metylenu). W
pierwszym przypadku, po spuszczeniu warstwy dolnej
(wodnej), należy warstwę organiczną również wylad do
kolby stożkowej. Następnie warstwę wodną przenosi
siÄ™ ponownie do rozdzielacza i ponownie ekstrahuje
nowÄ… porcjÄ… rozpuszczalnika. W przypadku
stosowania rozpuszczalnika  cięższego od wody,
roztwór wodny pozostaje w rozdzielaczu i może byd
wytrzÄ…sany z kolejnymi porcjami rozpuszczalnika. W
każdym przypadku należy upewnid się, czy warstwa
wodna znajduje się na górze, czy na dole rozdzielacza.
W tym celu należy zaznaczyd na rozdzielaczu granicę
faz (np. pisakiem), a następnie dodad nieco wody.
Zwiększy się wówczas oczywiście objętośd warstwy
wodnej. Poniższe rysunki przedstawiają sposób poprawnego posługiwania się rozdzielaczem.
Po ekstrakcji roztwór organiczny jest nasycony wodą i należy go osuszyd. Do tego celu stosuje się
różne sole tworzące hydraty (np. siarczan(VI) magnezu, siarczan(VI) sodu, chlorek wapnia). Roztwór
pozostawia się nad środkiem suszącym przez ok. 20 min., mieszając od czasu do czasu. Następnie
odsącza się środek suszący przez fałdowany sączek i przemywa go małą ilością rozpuszczalnika. Z
kolei usuwa się rozpuszczalnik, stosując wyparkę obrotową, a pozostałośd poddaje się destylacji lub
krystalizacji.
Aparat Soxhleta składa się z trzech części, połączonych najczęściej za pomocą szlifów: kolby kulistej
(1) , ekstraktora (2), i chłodnicy zwrotnej (3). Ekstrahowane ciało stałe umieszcza się w gilzie (4)
wykonanej z grubej bibuły, tkaniny bądz
siatki z cienkiego drutu. W kolbie znajduje siÄ™ lotny
rozpuszczalnik, który wrze przy podgrzewaniu kolby za pomocą płaszcza grzejnego (7), a jego pary
rurką (5) przechodzą do chłodnicy zwrotnej. Po skropleniu rozpuszczalnik gromadzi się w środkowej
części aparatu (2), gdzie znajduje się gilza. Ciecz z wyekstrahowaną substancją samoczynnie,
poprzez zamknięcie syfonowe (6), przelewa się do kolby, skąd rozpuszczalnik jest ponownie
oddestylowywany. Dzięki zamkniętemu obiegowi i destylacji rozpuszczalnika próbkę można
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba
Biotechnologiczne metody w ochronie środowiska, wybrane zagadnienia z biotechnologii  studia II stopnia
Dwiczenie 4 Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
ekstrahowad wielokrotnie świeżymi porcjami, przy stosunkowo niewielkiej ilości użytego medium ekstrahującego. Ekstrakcja w
aparacie Soxhleta jest procesem dośd powolnym, jednak nie wymaga ciągłego nadzoru. Zastosowanie automatycznych
zestawów do prowadzenia ekstrakcji przyśpiesza jej przebieg oraz umożliwia zmniejszenie zużycia rozpuszczalników.
Wykonanie dwiczenia
1. Biodegradacja substancji tłuszczowych w zaolejonej ziemi bielącej (ZZB) z wykorzystaniem biopreparatów
1.1. Przygotowad w kolbie stożkowej 600 cm3 pożywki PM o składzie:
MgSO4 x 7H2O - 0,2 g
(NH4)2HPO4 - 1,0 g
K2HPO4 - 1,0 g
NaCl - 5,0 g
1.2. Do trzech pojemników PCV wprowadzid po ok. 1-2 kg mieszaniny ZZB i trocin w proporcji 6:4
1.3. W 200 cm3 przygotowanej wcześniej pożywki PM rozpuścid dostarczone przez prowadzącego biopreparaty: A i B, w
ilości 20g/200 cm3.
1.4. Do pierwszego pojemnika wprowadzid zawiesinÄ™ biopreparatu A, do drugiego zawiesinÄ™ biopreparatu B. Trzeci
pojemnik stanowi próbę kontrolną  wprowadzamy do niego pozostałą częśd pożywki (bez dodatku biopreparatów).
1.5. Zawartośd wszystkich pojemników dokładnie mieszamy i oznaczamy w nich początkową zawartośd substancji
tłuszczowej  metodą wagową poprzez ekstrakcję w aparacie Soxleta eterem etylowym;
1.6. Biodegradację prowadzimy przez okres 30 dni, w temperaturze pokojowej, co kilka dni mieszając i zwilżając zawartośd
pojemników pożywką PM.
1.7. Po miesiącu powtarzamy oznaczenie dla każdego wariantu badawczego.
2. Ekstrakcja substancji tłuszczowych w aparacie Soxhleta
2.1. Odważyd 5 g odpadów z dokładnością do 0,01 mg. Przenieśd odważoną próbkę do gilzy wykonanej a bibuły filtracyjnej,
od góry gilzę zamknąd watą i całośd umieścid w nasadce ekstrakcyjnej.
2.2. Do wysuszonej kolby okrągło dennej o pojemności 250 cm3 wprowadzid kamyki wrzenie  kolbę zważyd z dokładnością
do 0,01mg,
2.3. Następnie kolbę umieścid na czaszy grzejnej, zamontowad na niej nasadkę ekstrakcyjną. Do ekstraktora wlewad eter
naftowy tak długo, aż przeleje się do kolby. Następnie dodad jeszcze połowę tej ilości eteru. Do nasadki ekstraktora
podłączyd chłodnice zwrotną.
2.4. Włączyd przepływ wody chłodzącej i rozpocząd ogrzewanie. Utrzymywad stan łagodnego wrzenia (temperatura ok.
700C) przez 1 godzinÄ™ (czas ekstrakcji).
2.5. Wyłączyd ogrzewanie. Odparowywad eter naftowy na wyparce rotacyjnej do objętości około 1-2 ml.
2.6. Usunąd rozpuszczalnik susząc kilkanaście minut pod wyciągiem, aż do zaniku zapachu eteru naftowego.
2.7. Kolbę wraz z ekstraktem zważyd i wyznaczyd masę wydzielonej substancji tłuszczowej. Zawartośd tłuszczu podad w
procentach.
Obliczenie zawartości tłuszczu (X) w procentach:
gdzie:
k  masa kolby z tłuszczem po ekstrakcji i odparowaniu eteru *g+
m  masa kolby przed ekstrakcjÄ… *g+
c  masa odważki odpadów tłuszczowych *g+
3. Opracowanie wyników
Na podstawie oznaczeo zawartości tłuszczu przed i po biodegradacji określid aktywnośd biodegradacyjna zastosowanych
biopreparatów w stosunku do mikroflory autochtonicznej (próba kontrolna)
4. Literatura
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki A
ódzkiej; 2000
- Pn-76 R-64753; Oznaczanie zawartości tłuszczu surowego
ProwadzÄ…cy: dr SÅ‚awomir Wierzba