Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
http://www.genetyka-ginekolog.pl/
Techniki molekularne z przykładami
Jedną z podstawowych technik wykorzystywanych w genetyce molekularnej jest RFLP (ang. restriction fragments
length polymorphism, czyli polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych). RFLP polega na analizie
polimorfizmu, czyli różnic długości fragmentów DNA powstałych na skutek oddziaływania enzymu restrykcyjnego na
cząsteczkę badanego DNA. Genomowy DNA badanej osoby przecinany jest przez enzym restrykcyjny z grupy
endonukleaz w określonych miejscach restrykcyjnych, o charakterystycznej sekwencji nukleotydów, precyzyjnie
rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny.
W zależności od liczby miejsc restrykcyjnych w DNA i odległości między nimi, po analizie restrykcyjnej
otrzymujemy określoną liczbę fragmentów restrykcyjnych o adekwatnej długości. Zastosowanie RFLP polega na
analizie polimorfizmu badanego DNA, jak również pośrednio na wykrywaniu mutacji.
W przypadku mutacji dotyczącej miejsca restrykcyjnego może nastąpić zmiana w sekwencji DNA, której
konsekwencją jest zanik lub pojawienie się dodatkowego miejsca restrykcyjnego, w zależności od typu mutacji.
Obserwujemy to w postaci zmienionej liczby fragmentów DNA powstałych po analizie restrykcyjnej. Gdy mutacja nie
dotyczy miejsca restrykcyjnego i ma charakter dużej (powyżej 50 pz) insercji lub delecji, można ją wyodrębnić na
podstawie zmienionej długości fragmentu, w obrębie którego miała miejsce.
Długość fragmentów DNA otrzymanych po działaniu enzymu restrykcyjnego na cząsteczkę DNA określa się na
podstawie rozdziału elektroforetycznego w żelach agarozowych, w obecności markerów wielkości.
Technika RFLP stanowi pierwszy etap techniki Southerna (ang. Southern blotting).
Jest to hybrydyzacja, zastosowana po raz pierwszy przez Southerna w 1975 r. w celu identyfikacji określonego
fragmentu DNA w materiale badanym. Polega na rozdziale fragmentów restrykcyjnych DNA w żelu agarozowym,
przeniesieniu na filtr nitrocelulozowy i denaturacji in situ.
Jednoniciowe fragmenty DNA na filtrze zostają poddane hybrydyzacji (tworzą stabilną dwuniciową strukturę) z
wyznakowaną sondą, a następnie po odpłukaniu i wysuszeniu filtru przeprowadza się autoradiografię. Sondy
molekularne stosowane w badaniach genomowego DNA są to oligonukleotydy (jednoniciowe fragmenty DNA)
komplementarne do sekwencji, którą zamierzamy zidentyfikować. Sonda molekularna przed hybrydyzacją zostaje
wyznakowana radioaktywnie izotopami 32P lub 35S. Stosuje się również nieradioaktywne znakowanie biotyną lub
związkami fluoryzującymi. Miejsca gdzie przyłączyła się sonda molekularna są widoczne na kliszy fotograficznej w
postaci prążków.
Ważnym momentem w diagnostyce molekularnej stało się opracowanie reakcji PCR (ang. polymerase chain reaction,
czyli łańcuchowa reakcja polimerazy), która pozwala przy użyciu enzymu - termostabilnej polimerazy DNA -
zamplifikować, czyli zwielokrotnić odcinek DNA znajdujący się między parą starterów (ang. primers). Startery są
krótkimi, jednoniciowymi fragmentami DNA, komplementarnymi do obydwu nici matrycy, którą stanowi cząsteczka
badanego DNA. Reakcja PCR przebiega przy nadmiarze starterów, które hybrydyzują ze zdenaturowaną matrycą w
temperaturze 55-65oC, wydłużanie starterów (dobudowywanie kolejnych nukleotydów komplementarnych do
matrycy) zachodzi w 72oC, natomiast denaturacja (zerwanie wiązań wodorowych i uzyskanie pojedynczych nici)
matrycy i powstałych produktów zachodzi w temperaturze 94oC. Reakcja PCR składa się najczęściej z 30
powtarzających się cykli i przeprowadzana jest w urządzeniu zwanym termocyklerem. Pojedynczy cykl trwa zwykle
nie dłużej niż 3 minuty, a powstające produkty służą jako matryce w cyklu następnym.
Metoda PCR pozwala na zwielokrotnienie (nawet miliardkrotne) niewielkich ilości DNA przed dalszą analizą i jest
metodą wyjściową dla większości badań. Można między innymi w obrębie zamplifikowanych fragmentów poszukiwać
mutacji czyli zmian w sekwencji DNA, które stanowią podłoże wielu chorób dziedzicznych. Podstawową zaletą tej
metody jest szybkość (około 2,5 godziny) i pełna automatyzacja, ponadto nie wymaga ona stosowania radioizotopów.
Warunkiem jej zastosowania jest znajomość sekwencji fragmentu DNA, który chcemy zamplifikować przynajmniej w
strona 1 / 8
Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
obrębie starterów.
Metoda SSCP (ang. single strand conformation polymorphism, czyli polimorfizm konformacji jednoniciowych
fragmentów DNA) jest oparta na obserwacji, że nawet mutacja punktowa zmienia konformację (czyli strukturę
przestrzenną) pojedynczej nici DNA. W konsekwencji, zmieniona konformacja powoduje, że dany fragment DNA
migruje w czasie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym odmiennie od fragmentu, w którym nie występuje mutacja.
Tak więc, w przypadku analizy produktów reakcji PCR odpowiadających badanemu fragmentowi DNA, migracja
jednej z nici DNA danego pacjenta w sposób odmienny od analogicznych nici osób z grupy kontrolnej, wskazuje na
obecność mutacji lub na polimorfizm badanego regionu. Głównymi czynnikami wpływającymi na wykrywalność
mutacji tą metodą, szacowaną na około 90% są: długość analizowanego fragmentu (która nie powinna przekraczać 200
par zasad) oraz jego struktura.
Metoda analizy heterodupleksów (HA - ang. heteroduplex analysis) jest również wykorzystywana do poszukiwania
mutacji i stanowi bardzo dobre uzupełnienie metody SSCP. Oparta jest na różnicy w migracji dwuniciowych
fragmentów DNA w żelu poliakrylamidowym, związanej z ich odmienną konformacją. Dwuniciowe fragmenty DNA, w
przypadku gdy matrycą do reakcji PCR był jednocześnie prawidłowy i zmutowany typ badanego fragmentu DNA, to
tzw. homodupleksy i heterodupleksy tworzone podczas ostatniego cyklu PCR między nićmi prawidłowymi i
zmutowanymi. W przypadku braku mutacji, heterodupleksy nie tworzą się, a na żelu poliakrylamidowym obserwujemy
tylko homodupleksy. Obydwie procedury SSCP i HA użyte jednocześnie do analizy mutacji punktowych zwiększają
możliwość ich wykrycia do 99%.
Ponadto, w diagnostyce molekularnej stosowanych jest wiele odmian i wariantów technik SSCP i HA, których
szczegółowe omówienie przekracza jednak ramy tego opracowania.
Sekwencjownowanie DNA jest najdokładniejszą metodą pozwalającą na przeanalizowanie sekwencji nukleotydów w
odcinku DNA liczącym 400-700 par zasad. W diagnostyce medycznej pozwala na detekcję wszystkich mutacji
dotyczących sekwencji DNA, a ponadto umożliwia poznanie sekwencji nowych genów.
Procedura sekwencjonowania opisana przez zespół F. Sangera polega na analizie produktów syntezy in vitro DNA na
jednoniciowej matrycy, począwszy od przygotowanego oligonukleotydowego startera, komplementarnego do końca 3'
matrycy. W skład czterech mieszanin reakcyjnych wchodzą cztery różne dideoksytrifosforany nukleotydów (ddNTP),
powodujące terminację syntezy w pozycji w której zostaną włączone do rosnącej nici. Nukleotydy terminujące
dodawane są w takim stężeniu, aby były włączane do syntetyzowanej nici stosunkowo rzadko, co sprawia, że w
końcowej mieszaninie reakcyjnej powstaje zestaw fragmentów DNA, kończących się danym nukleotydem
terminującym, o długości rosnącej stopniowo po jednym nukleotydzie. Sanger i wsp. wykorzystywali nukleotydy
blokujące reakcję znakowane radioaktywnie i odczytywali sekwencję DNA z klisz po autoradiografii. Obecnie coraz
częściej stosuje się znakowanie nieradioaktywne i automatyczny odczyt sekwencji przy pomocy czytnika laserowego,
który jest sprzężony z komputerem. Dzięki odpowiedniemu oprogramowaniu otrzymujemy gotowy wydruk
analizowanej sekwencji.
Strategia postępowania
Jak wynika z powyższego, skrótowego przedstawienia dostępnych w genetyce molekularnej podstawowych technik
diagnostyczno-badawczych, genetyk kliniczny posiada szeroki arsenał środków mogących posłużyć do identyfikacji
nieprawidłowości materiału genetycznego. Musi on jednak zawsze przemyśleć strategię postępowania
najodpowiedniejszą do danego przypadku klinicznego. Skomplikowanie nowoczesnych metod diagnostyki genetycznej
jest jednak tak duże, że genetyk kliniczny na co dzień współpracuje zarówno z cytogenetykami, jak i biologami
molekularnymi.
W przypadkach podejrzenia aberracji chromosomowych, podejmuje się w pierwszej kolejności standardowe badanie
chromosomów metafazowych, barwionych techniką GTG (prążki G). W przypadku niektórych wątpliwości
diagnostycznych w aberracjach struktury chromosomów, pomocne bywa zastosowanie innych technik barwienia
chromosomów, a przede wszystkim analizy chromosomów prometafazowych, czyli techniki badania cytogenetycznego
o wysokiej rozdzielczości (HRBT - ang. high resolution banding technique). Ostatecznym narzędziem badań
cytogenetycznych, pozwalającym na pewną identyfikację np. materiału translokacyjnego lub chromosomów
strona 2 / 8
Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
markerowych jest flurescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH - ang. fluorescent in situ hybridization). Technika ta łączy
klasyczną cytogenetykę z biologią molekularną. Pozwala bowiem, z wykorzystaniem systemów komputerowej analizy
obrazu mikroskopowego, na diagnostykę chorób powodowanych większymi mutacjami genowymi - np. duplikacjami
lub delecjami dużych fragmentów genów (jak ma to miejsce np. w chorobie Charcot-Marie-Tooth). Tak więc klasyczne
narzędzie cytogenetyczne, jakim jest mikroskop optyczny, pozwala w takich okolicznościach na diagnostykę
wybranych chorób jednogenowych.
Tym niemniej, w większości chorób jednogenowych, jedyną strategią diagnostyczną jest stosowanie technik biologii
molekularnej. Obecnie, w przypadkach genów sklonowanych (a więc o znanej sekwencji) rutynowym postępowaniem
jest wyizolowanie DNA, a następnie amplifikacja wybranego do diagnostyki fragmentu przy pomocy reakcji PCR. Za
optymalne postępowanie zmierzające do identyfikacji nieznanej mutacji uznawane jest łączne wykorzystanie techniki
SSCP i analizy heterodupleksów, a następnie sekwencjonowanie fragmentów DNA zidentyfikowanych w powyższy
sposób, jako posiadające zmiany w sekwencji DNA. W przypadkach poszukiwania znanych mutacji (np.
najpopularniejszych w danej populacji mutacji powodujących daną chorobę) stosowane są często gotowe zestawy
diagnostyczne, wykorzystujące często stosunkowo najprostszą technikę PCR-RFLP lub inne spośród wyżej
wymienionych technik biologii molekularnej.
W przypadkach genów, które nie zostały dotąd sklonowane, a jedynie zmapowane (czyli poznano ich lokalizację
chromosomową) możliwe jest jedynie wykorzystanie technik pośrednich, polegających na tzw. analizie sprzężeń
występowania choroby u członków kilkupokoleniowej rodziny z obecnością u nich polimorficznych markerów DNA,
zlokalizowanych w sąsiedztwie genu powodującego chorobę.
Jak dotąd jednak, większość genów powodujących u człowieka choroby jednogenowe, nie zostało sklonowanych, ani
zmapowanych. Stąd też, w większości przypadków chorób i zespołów jednogenowych diagnostyka molekularna nadal
nie jest dostępna. Sytuacja ta jednak, z całą pewnością zmieni się gwałtownie w ciągu kilku najbliższych lat ze względu
na intensywność prowadzonych badań.
Ważniejsze zespoły dysmorficzne, dla których sklonowano geny przyczynowe i poznano ich mutacje, wraz z
podaniem lokalizacji chromosomowej genów.
Zespół
Gen
Lokalizacja
chromosomów
Achondroplazja i dysplazja tanatoforyczna
FGFR3
4p16.3
Dysplazja kamptomeliczna
SOX9
17q24.3-q25.1
strona 3 / 8
Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
Dysplazja diastroficzna
DTDST
5q32-q33.1
Zespoły kraniosynostoz:
- Aperta
- Crouzona
- Pfeiffera
- Jackson-Weiss
FGFR2
10q26
Zespół Pfeiffera
FGFR1
8p11.2-p11.1
Zespół Saethre-Chotzen
TWIST
7p21
Kraniosynostoza typu Boston
MSX2
5q43-q35
Zespół Marfana
FBN1
15q21.1
Zespół Sticklera i dysplazja Kniesta
COL2A1
strona 4 / 8
Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
12q13.11-q13.12
Zespół Sticklera i zespół Marshalla
COL11A1
1p21
Zespół Sticklera i zespół Insley-Astley
COL11A2
6p21.3
Zespół Angelmana
UBE3A
15q11-q13
Zespół Martina-Bella
(łamliwego chromosomu X)
FMR1
Xq27.3
Zespół Beckwith-Wiedemann
IGF2
11p15.5
Zespół Holt-Oram
TBX5
12q24.1
Zespół WAGR
i zespół Denys-Drash
WT1
strona 5 / 8
Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
11p13
Zespół Simpson-Golabi-Behmel
GPC3
Xq26
Zespół Waardenburg typu I
PAX3
2q35
Zespół Waardenburg typu II
MITF
3p14.1-p12.3
Zespół Riegera
PITX2
4q25-q26
Zespół Aarskog
FGD1
Xp11.21
Zespół Ellis van Creveld
EVC
4p16
Zespół Cockayne
ERCC3
ERCC5
ERCC6
CKN1
strona 6 / 8
Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
2q21
13q33
10q11
chromosom 5
Zespół Bloom
BLM
15q26.1
Zespół Treacher-Collins
TCOF1
5q32-q33.1
Zespół Greiga
i zespół Palister-Hall
GLI3
7p13
Zespół Smith-Lemli-Opitz
DHCR7
11q12-q13
Zespół Rubinstein-Taybi
CREBBP
16p13.3
Zespół Williamsa
LIMK1
7q11.23
Chondrodysplasia punctata
strona 7 / 8
Stowarzyszenie na Rzecz Dzieci z Zaburzeniami Genetycznymi
Badania molekularne
ARSE
Xp22.3
Zespół Coffin-Lowry
RSK2
Xp22.2-p22.1
Wodogłowie sprzężone z chromosomem X
L1CAM
Xq28
Polisyndaktylia
HOXD13
2q31-q32
Zespół ręczno-stopowo-genitalny
HOXA13
7p15-p14.2
Schizencefalia
EMX2
10q26.1
Wybiórcza agenezja zębów
MSX1
4p16.1
strona 8 / 8