Ćwiczenie 1
Plazmidy bakteryjne  izolacja plazmidowego DNA
Plazmidy stanowią pozachromosomalny materiał genetyczny bakterii. Warunkują one szereg
cech fenotypowych jak oporność na leki, syntezę substancji o charakterze antybiotyków (bak-
teriocyn), toksyn i innych związków. Plazmidy występują w formie kolistych cząsteczek
DNA i różnią się między sobą pod względem wielkości oraz liczby kopii w komórce. W in-
żynierii genetycznej plazmidy wykorzystujemy często jako wektory do przenoszenia DNA
pomiędzy komórkami tych samych lub różnych organizmów.
Celem ćwiczenia jest izolacja z komórek E. coli plazmidów, które różnią się wielkością oraz
liczbą kopii dwoma różnymi metodami. DNA plazmidowe pUC19 i pUC98 będzie wykorzy-
stywane na kolejnych zajęciach/
Plazmidy: pUC19, pUC98, pK19mobGII, pBBRMCS-1 (KmR), pMP220
1. Izolacja plazmidowego DNA za pomocÄ… zestawu MINIPREP EXPRESS MATRIX "!
(BIO 101)
-ð 5 ml hodowli E. coli zawierajÄ…cej odpowiedni plazmid inkubować z wytrzÄ…saniem przez
noc w temp. 37ºC w pÅ‚ynnym podÅ‚ożu LB uzupeÅ‚nionym odpowiednim antybiotykiem
-ð w próbówce Eppednorfa odwirować 1,5 ml nocnej hodowli 1 min. przy 14 tys. RPM
(UWAGA!!! żeby zwiększyć wydajność izolacji niskokopijnych plazmidów, można
odwirować w tej samej próbówce dodatkową 1,5 ml porcję hodowli bakteryjnej)
-ð usunąć supernatant odsÄ…czajÄ…c go za pomocÄ… pompki wodnej
-ð osad bakteryjny dokÅ‚adnie zawiesić w 150 mðl buforu TCG, nie pozostawiajÄ…ce zbitych
grudek osadu bakterii
-ð dodać 300 mðl alkalicznego SDS (UWAGA! bufor przygotować na Å›wieżo przed użyciem z
2N NaOH i 10% SDS) i delikatnie wymieszać przez odwracanie
-ð dodać 230 mðl buforu octanowego i delikatnie wymieszać przez odwracanie (powinien
być widoczny biały osad)
-ð wirować 5 min.
-ð supernatant przenieść ostrożnie do nowej próbówki Epp. tak by nie pobrać biaÅ‚ego osadu
-ð dodać 400 mðl EXPRESS MATRIX (UWAGA! zawiesinÄ™ dokÅ‚adnie wymieszać przed
dodaniem) i zmieszać przez odwracanie ok. 5 razy (DNA plazmidowe wiąże się do złoża
silikonowego)
-ð wirować 30 sek., usunąć supernatant za pomocÄ… pompki wodnej
-ð dodać 500 mðl 70% etanolu i wymieszać, tak aby caÅ‚y osad doprowadzić do jednorodnej
zawiesiny
-ð wirować 30 sek., dokÅ‚adnie usunąć etanol odsÄ…czajÄ…c za pomocÄ… pompki wodnej
-ð osad podsuszyć w SpeedVacu (ok. 5 min)
-ð dodać 30 mðl wody i bardzo dokÅ‚adnie wymieszać za pomocÄ… koÅ„cówki do pipet
(UWAGA! dokładne zawieszenie kompleksu złoże-DNA zapewnia maksymalną wydaj-
ność elucji plazmidowego DNA)
-ð wirować 2 min.
-ð supernatant zawierajÄ…cy plazmidowe DNA przenieść do nowej próbówki Epp i zamrozić
w temp. -20Ú
Materiały
·ð bufor TC pH 8.0
Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM
EDTA 1 mM
·ð bufor TCG
glukoza 50 mM
Tris-HCl (pH 8.0) 25 mM
EDTA 10 mM
·ð bufor octanowy
octan potasu (5M) 60 ml
kwas octowy lodowaty 11.5 ml
H2O dest. 28.5 ml
·ð alkaliczny SDS
SDS 1%
NaOH 0.2 M
Przygotowany z 10% SDS i 2M NaOH bezpośrednio przed użyciem,
2. Izolacja plazmidowego DNA metodÄ… Holmsa, Quigley a
-ð 5 ml hodowli E. coli zawierajÄ…cej odpowiedni plazmid inkubować z wytrzÄ…saniem przez
noc w temp. 37ºC w pÅ‚ynnym podÅ‚ożu LB uzupeÅ‚nionym odpowiednim antybiotykiem
-ð w próbówce Eppednorfa odwirować 1,5 ml nocnej hodowli 1 min. przy 14 tys. RPM
(UWAGA!!! żeby zwiększyć wydajność izolacji niskokopijnych plazmidów, można
odwirować w tej samej próbówce dodatkową 1,5 ml porcję hodowli bakteryjnej)
-ð usunąć supernatant odsÄ…czajÄ…c go za pomocÄ… pompki wodnej
-ð osad bakteryjny bardzo dokÅ‚adnie zawiesić w 350 mðl buforu STET, nie pozostawiajÄ…ce
zbitych grudek bakterii (UWAGA bufor STET bardzo się pieni, należy pipetować go
bardzo delikatnie)
-ð dodać 25 mðl lizozymu o stęż. 10 mg/ml, zamieszać koÅ„cówkÄ… pipety
-ð mieszankÄ™ umieÅ›cić we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej na 40 sekund i natychmiast odwirować 10
min.
-ð supernatant przenieść ostrożnie do nowej próbówki Epp. tak by nie pobrać osadu z
próbówki
-ð dodać 0,6 objÄ™toÅ›ci izopropanolu, bardzo dokÅ‚adnie wywieszać przez odwracanie
-ð wirować 15 min, supernatant delikatnie odsÄ…czyć za pomocÄ… pompki próżniowej, a osad
wypłukać 0,5 ml 70% etanolu,
-ð odwirować 5 min, supernatant delikatnie odsÄ…czyć za pomocÄ… pompki próżniowej
-ð osad podsuszyć w SpeedVacu (ok. 5 min), a nastÄ™pnie rozpuÅ›cić w 20 mðl buforu TC +
RNaza 20 mðg/ml)
-ð zamrozić w temp. -20Ú
·ð Bufor STET
NaCl 0.1 M
Tris HCl pH 8.0 10 mM
EDTA pH 8.0 1 mM
Triton X-100 5 %
·ð bufor TC+RNaza
Bufor TC + RNaza 20 mðg/ml
Ćwiczenie 2
Izolacja całkowitego DNA z bakterii
Metody rozdziału DNA w żelach agarozowych
Celem ćwiczenia jest izolacja genomowego (całkowitego DNA) bakterii oraz rozdział elektroforetyczny próbek
genomowego DNA oraz plazmidowego DNA wyizolowanego na poprzednich zajęciach i porównanie obrazu
elektroforetycznego. W przypadku rozdziału plazmidowego DNA należy zaobserwować zależność drogi migra-
cji od wielkości cząsteczki plazmidu, obecność form konformacyjnych, ilości i jakości DNA, zależnie od zasto-
sowanej metody izolacji plazmidu
A) Izolacja genowego DNA za pomocÄ… zestawu Genomic DNA Prep Plus
Zasada działania zestawu do izolacji genomowego DNA opiera się (podobnie jak w przypadku plazmi-
du) na zdolności wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w buforach o wysokiej sile jonowej. Komórki
bakterii poddawane sÄ… lizie w uniwersalnym buforze lizujÄ…cym (LT), zawierajÄ…cym sole i detergenty niejonowe.
Dodatkowo w procesie lizy uczestniczy silna proteaza (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy ko-
mórek i degradacji wszystkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na minikolumnę ze specjalnym zło-
żem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim, zaś zanieczyszczenia zostają wypłukane z
kolumny buforem A1 zawierajÄ…cym 96% etanol. Oczyszczone DNA wymywane jest z kolumny niskojonowymi
buforami np. buforem TC lub wodą. Stopień oczyszczenia DNA pozwala na jego wykorzystanie w analizie re-
strykcyjnej i PCR.
Protokół izolacji genomowego DNA
1. W próbówce Eppendorfa odwirować 1.5 - 5 ml (zależnie od gęstości) hodowli bakteryjnej (5 min./ 14 tys.
RPM)
2. Osad zawiesić w 100 mðl buforu TE
3. Dodać 200mðl uniwersalnego buforu lizujÄ…cego LT
4. Dodać 20 mðl roztworu Proteinazy K
5. CaÅ‚ość wymieszać i inkubować 20 min w temp. 37ºC
6. Przenieść próbówkÄ™ do 75ºC i inkubować przez 5 min.
7. Próbówkę intensywnie wytrząsać np. na worteksie przez 20 sek.
8. Wirować przez 5 min (15 tys. RPM)
9. Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do czyszczenia genomowego DNA
10. Kolumnę umieścić nowej próbówce, a następnie wirować 1 min. (15 tys. RPM)
11. WyjÄ…c minikolumnÄ™ wraz z próbówkÄ… i dodać do kolumny 500 mðl r-ru pÅ‚uczÄ…cego A1
12. Wirować 1 min przy 15 tys. RPM
13. KolumnÄ™ umieÅ›cić nowej próbówce i dodać do kolumny 400 mðl r-ru pÅ‚uczÄ…cego A1
14. Wirować 1 min przy 15 tys. RPM
15. OsuszonÄ… kolumnÄ™ umieÅ›cić w nowej próbówce i do zÅ‚oża znajdujÄ…cego siÄ™ na dnie kolumny dodać 30 mðl
wody dejonizowanej.
16. Inkubować próbówkę przez 5 min. w temp. pokojowej
17. Kolumnę umieścić nowej próbówce i wirować 1 min przy 15 tys. RPM
18. MinikolumnÄ™ usunąć a oczyszczone DNA znajdujÄ…ce siÄ™ w eluacie zamrozić w -20ºC.
19. Sprawdzić ilość wyizolowanego DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym.
B) Elektroforeza agarozowa DNA
Elektroforeza w żelach agarozowych i poliakrylamidowych jest techniką używaną do rozdzia-
łu, oznaczania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Rozdział polega na migracji
rozdzielanych substancji pod wpływem przyłożonego prądu elektrycznego. W obojętnym pH
DNA ma ładunek ujemny i wędruje do anody. Stosowane techniki różnią się od siebie
zdolnością rozdzielczą i zakresem rozdziału.
Przygotowanie żelu agarozowego
-ð przygotować 100 ml 0,7% żelu agarozowego w buforze elektroforetycznym 1X stęż. TBE. RozpuÅ›cić aga-
rozÄ™ we wrzÄ…cej Å‚az
ni wodnej i gotować jeszcze przez co najmniej 10 min.
-ð ostudzić żel do temp. ok. 60ºC i wylać żel do rynienki tak aby ustawiony nad niÄ… grzebieÅ„ zostaÅ‚ zanurzony
w żelu i spowodował powstanie studzienek
-ð po zastygniÄ™ciu żelu (minimum 30 min) wyjąć grzebieÅ„ i napeÅ‚nić aparat buforem 1X stęż. TBE do wysoko-
ści 5 mm nad powierzchnię żelu
Przygotowanie próbek DNA
Do sprawdzenia iloÅ›ci wyizolowanego DNA używany jest zwykle niewielka ilość (kilka mðl) uzyskanego
w trakcie izolacji roztworu DNA. Dla zwiększenia objętości i ograniczenia strat przy nakładaniu do próbki doda-
jemy kilka mðl buforu TC lub wody. Do tak przygotowanej próbki dodajemy 6x stężonego buforu obciążajÄ…cego
(do końcowego stężenia 1X). Bufor obciążający służy do zagęszczenia próbki DNA tak by umożliwić jej nało-
żenie do studzienki w żelu. Bufor obciążający zawiera jeden lub dwa barwniki do elektroforezy tj. ksylen cyja-
nol (0,25%) i błękit bromofenolowy (0,25%) oraz 40% sacharozę lub 30% glicerol. Barwniki elektroforetyczne
mirują w żelu razem z cząsteczkami DNA. Błękit bromofenolowy migruje ok. 2,2 razy szybciej niż ksylen cyja-
nol. Szybkość migracji błękitu bromofenolowego odpowiada szybkości migracji liniowej cząsteczki dsDNA
(dwuniciowe DNA) o wielkości 300pz, podczas gdy ksylen cyjanol migruje z szybkością równą fragmentom
dsDNA o wielkości 4000pz.
UWAGA!!! próbki DNA do elektroforezy przygotowujemy w nowych próbówkach Epp, pozostałą część
przechowujemy do dalszych oznaczeń. Całość przygotowanej próbki nakładamy na żel.
-ð wÅ‚Ä…czyć zasilanie ze stabilizatora prÄ…du do aparatu do elektroforezy, dla uzyskanie optymalnego rozdziaÅ‚u
napięcie powinno wynosić ok. 5V/cm odległości pomiędzy elektrodami aparatu do elektroforezy (w naszym
przypadku ok. 120V)
-ð prowadzić elektroforezÄ™ aż do momentu kiedy barwnik osiÄ…gnie 3/4 dÅ‚ugoÅ›ci żelu
-ð wyÅ‚Ä…czyć zasilanie, wyjąć żel wraz z rynienkÄ… i umieÅ›cić w wanience zawierajÄ…cej wodny roztwór bromku
etydyny (0,5 mg/ml) barwić żel co najmniej 10 -15 min.
-ð podÅ›wietlić żel lampÄ… UV i obserwować powstaÅ‚e prążki DNA. Zaobserwować odmiennÄ… ruchliwość elek-
troforetyczną różnych form DNA plazmidowego i genomowego.
UWAGA!!! Bromek etydyny jest silnym mutagenem - stosować rękawiczki i unikać bezpośredniego kon-
taktu roztworu bromku etydyny ze skórą
Materiały
·ð bufor TBE-1 x stężony (Tris-boranowy)
Tris base 10,8 g
kwas borowy 5,5 g
0.5M EDTA pH 8.0 4 ml
H2O dest. do 1000 ml
·ð bufor obciążajÄ…cy
błękit bromofenolowy 0,25%
sacharoza 40%
Charakterystyka DNA: oznaczanie stężenia, ciężaru cząsteczkowego i form konforma-
cyjnych DNA przez elektroforezę w żelu agarozowym.
Elektroforeza w żelach agarozowych i poliakrylamidowych jest techniką używaną do rozdziału, ozna-
czania i oczyszczania kwasów nukleinowych i białek.
Rozdział polega na migracji rozdzielanych substancji pod wpływem przyłożonego prądu elektrycznego. W obo-
jętnym pH DNA ma ładunek ujemny i wędruje do anody.
Stosowane techniki różnią się od siebie zdolnością rozdzielczą i zakresem rozdziału.
Żele poliakrylamidowe są najbardziej efektywne, rozdzielają cząsteczki DNA o wielkości od 5 do 500
pz, a w pewnych warunkach można rozdzielić fragmenty DNA różniące się jednym nukleotydem. Można rów-
nież rozdzielić dwa łańcuchy DNA o takiej samej długości jeśli różnią się one sekwencją nukleotydów.
W żelach agarozowych można rozdzielić fragmenty od 200pz do 50000pz, ale ich zdolność rozdzielcza
jest niższa.
W elektroforezie w żelach agarozowych szybkość migracji liniowych cząstek DNA jest odwrotnie pro-
porcjonalna do log10 z ilości par zasad. Duże cząsteczki migrują wolniej, gdyż większa jest siła tarcia podczas
migracji. Liniowe cząsteczki DNA zostają zorientowane przez pole elektryczne i migrują równolegle do lini
pola.
Na szybkość migracji fragmentów w żelu wpływa:
·ð wielkość fragmentów DNA - mniejsze fragmenty wÄ™drujÄ… szybciej
·ð stężenie żelu:
-wzrost stężenia żelu obniża szybkość migracji
-wzrost stężenia żelu wpływa również na zakres rozdziału cząsteczek DNA
Stężenie żelu Wielkość fragmentów efektywnie rozdzielanych
0,3% 5-60kpz
0,6% 1-20kpz
0,9% 0,5-7kpz
1,2% 0,4-6kpz
1,5% 0,2-3kpz
2% 0,1-2kpz
·ð konformacja DNA
3 formy konformacyjne plazmidowego DNA, superspiralna kolista (CCC), otwarta kolista (OC) i linio-
wa (L) wędrują przez żel z różną szybkością. Zwykle najszybciej wędruje forma CCC, następnie forma L, a
najwolniej forma OC. Czasami jednak w zależności od stężenia żelu, wartości przyłożonego prądu i siły jonowej
buforu forma liniowa wyprzedza formę CCC. By określić który prążek jest cząsteczką DNA o formie CCC moż-
na przeprowadzić doświadczenie polegające na elektroforezie próbki w żelach zawierających różne stężenia
bromku etydyny (EtBr). Bromek etydyny rozwija superspiralne skręty DNA i powoduje, że forma CCC migruje
wolniej.
·ð napiÄ™cie prÄ…du
Przy niskich napięciach szybkość migracji jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Jeśli napięcie
wzrasta to szybkość migracji cząstek DNA wzrasta w zależności od wielkości. Najlepsze rozdziały elektofore-
tyczne są otrzymywane przy zastosowaniu prądu ok. 5V/cm odległości pomiędzy elektrodami.
Żele agarozowe używane są zwykle do horyzontalnej elektroforezy zanurzeniowej określanej jako
"submarine electrophoresis", gdyż żel jest całkowicie zatopiony w buforze w którym wykonywana jest elektro-
foreza.
Używane są trzy rodzaje buforów:
·ð boranowy (Tris Borate Electrophoretic buffer - TBE)
·ð octanowy (Tris Acetate Electrophoretic buffer - TAE)
·ð fosforanowy (Tris Phosphate Electrophoretic buffer - TPE)
Bufory różnią się siłą jonową i pojemnością buforową. Najczęściej używany jest bufor boranowy-TBE.
Przygotowany 10x stężony roztwór wyjściowy jest rozcieńczany do roztworu roboczego (1x) przed przygotowa-
niem żelu.
Przygotowanie żelu.
Żele agarozowe są przygotowywane na płytkach szklanych lub w tzw. rynienkach. Przed
wylaniem żelu na rynienkę należy zakleić plastrem jej boczne krawędzie lub umieścić ry-
nienkę w aparacie do wylewania żeli. Objętość przygotowanego żelu zależy od pojemności
płytki.
W celu przygotowania żelu należy do odważonej agarozy dodać odpowiednią objętość buforu do
elektroforezy np. TBE. Taką zawiesinę należy gotować do całkowitego rozpuszczenia agarozy, a następnie
ochÅ‚odzić do temperatury ok. 45°ðC. Å»el wylać na uprzednio przygotowanÄ… pÅ‚ytkÄ™ szklanÄ… lub rynienkÄ™ i ustawić
grzebień. Grzebień powinien być ustawiony równolegle do krawędzi żelu, a jego zęby powinny się znajdo-
wać w odległości ok. 0,5-1 mm od dolnej powierzchni. Żel krzepnie ok. 20 min. w zależności od temperatury
otoczenia. Å»ele zawierajÄ…ce mniej niż 0,7% agarozy sÄ… przygotowywane w chÅ‚odni w temperaturze 4°ðC. Po
zastygnięciu żelu należy ostrożnie wyjąć grzebień przytrzymując delikatnie powierzchnię żelu. Przygotowany
żel należy umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać buforem 1 x TBE.
Przygotowanie próbek DNA.
Do sprawdzenia iloÅ›ci wyizolowanego DNA używany jest zwykle 1mðl roztworu DNA. Dla zwiÄ™kszenia
objÄ™toÅ›ci i ograniczenia strat przy nakÅ‚adaniu do próbki dodajemy 4mðl buforu TC lub wody. Do tak przygotowa-
nej próbki dodajemy 1mðl 6x stężonego buforu obciążajÄ…cego. Bufor obciążajÄ…cy sÅ‚uży do zagÄ™szczenia próbki
DNA tak by umożliwić jej nałożenie do studzienki w żelu. Bufor obciążający zawiera jeden lub dwa barwniki do
elektroforezy tj. ksylen cyjanol (0,25%) i błękit bromofenolowy (0,25%) oraz 40% sacharozę lub 30% glicerol.
Barwniki elektroforetyczne migrują w żelu razem z cząsteczkami DNA. Błękit bromofenolowy migruje ok. 2,2
razy szybciej niż ksylen cyjanol. Szybkość migracji błękitu bromofenolowego odpowiada szybkości migracji
liniowej cząsteczki dsDNA (dwuniciowe DNA) o wielkości 300pz, podczas gdy ksylen cyjanol migruje z szyb-
kością równą fragmentom dsDNA o wielkości 4000pz.
Po nałożeniu próbek na żel i podłączeniu do zasilacza ustawiamy napięcie na ok. 120-140V. Elektrofo-
rezę prowadzimy do momentu, gdy błękit bromofenolowy osiągnie 3/4 długości żelu. Po odłączeniu napięcia żel
przenosimy do naczynia zawierającego roztwór bromku etydyny. Bromek etydyny jest silnym mutagenem,
dlatego czynności te należy wykonywać w rękawiczkach.
Bromek etydyny
Bromek etydyny jako barwnik akrydynowy wnika pomiędzy nici DNA specyficznie wybarwiając żel.
Po oświetleniu żelu lampą UV 260 nm DNA świeci na czerwono. Również niezwiązany z DNA bromek świeci
na czerwono. Dla odpłukania niespecyficznie związanego z żelem bromku, żel zostawiamy na kilka godzin w
wodzie destylowanej. Czasami bromek etydyny jest dodawany bezpośrednio do żelu. W czasie elektroforezy
bromek wędruje w przeciwnym kierunku niż DNA i jest usuwany z żelu wybarwiając specyficznie DNA.
Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym
W elektroforezie w żelu agarozowym można rozdzielić efektywnie fragmenty DNA o wielkości do kil-
kudziesięciu tysięcy par zasad. Rozdziały takie można uzyskać w niskoprocentowych żelach (0,2%-0,35%), ale
takie żele są bardzo nietrwałe i wymagają specjalnej obróbki. Rozdział dużych fragmentów rzędu kilkuset kpz
uzyskuje się przez elektroforezę w zmiennym polu elektrycznym. Duże cząsteczki DNA są uwięzione w żelu i
przy zmianie biegunów pola elektrycznego duże fragmenty wymagają dłuższego czasu na zmianę orientacji
podczas, gdy krótsze fragmenty szybciej zmieniają orientację i szybciej migrują. W oryginalnie opisanej meto-
dzie uzyskano rozdziały fragmentów o wielkości 2Mpz (mega par zasad), a dalsze usprawnienia metody umoż-
liwiają rozdział 5Mpz DNA.
Ćwiczenie 4
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do konstrukcji mapy fizycznej DNA
Celem ćwiczenia jest konstrukcja mapy fizycznej wstawki plazmidu pUC98 przy użyciu enzymów restrykcyj-
nych. W trakcie ćwiczeń studenci przygotowują reakcje trawienia DNA pojedynczymi enzymami restrykcyjny-
mi i kombinacjami enzymów podwójnych, a następnie oznaczają wielkości fragmentów restrykcyjnych w opar-
ciu o ruchliwość elektroforetyczną w żelu agarozowym i porównanie drogi migracji fragmentów DNA z marke-
rami wielkości. Na tej podstawie konstruowana jest mapa restrykcyjna wstawki plazmidu pUC98.
Przygotowanie reakcji trawienia plazmidowego DNA enzymami restrykcyjnymi
UWAGA!!! Enzymy restrykcyjne należy trzymać w lodzie!!!!
Ważna jest kolejność dodawania składników mieszaniny: H2O, DNA, bufor, enzym!!!
A) trawienia pojedynczymi enzymami
UWAGA!!! koÅ„cowa objÄ™tość mieszaniny reakcyjnej wynosi 15µl
pUC98 EcoRI pUC98 HindIII pUC98 PstI
ok. 500 ng DNA pUC98 ok. 500 ng DNA pUC98 ok. 500 ng DNA pUC98
1,5 µl bufor EcoRI 1,5 µl bufor HindIII 1,5 µl bufor PstI
1,5 µl enzym EcoRI 1,5 µl enzym HindIII 1,5 µl enzym PstI
H2O dejonizowana, jałowa do H2O dejonizowana, jałowa do H2O dejonizowana, jałowa do
koÅ„cowej 15 µl koÅ„cowej 15 µl koÅ„cowej 15 µl
B) Trawienie podwójnymi kombinacjami enzymów restrykcyjnych
UWAGA!!! koÅ„cowa objÄ™tość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20µl
pUC98 EcoRI/HindIII pUC98 EcoRI/PstI pUC98 HindIII/PstI
ok. 500 ng DNA pUC98 ok. 500 ng DNA pUC98 ok. 500 ng DNA pUC98
1 µl bufor EcoRI 1 µl bufor EcoRI 1 µl bufor PstI
1 µl bufor HindIII 1 µl bufor PstI 1 µl bufor HindIII
1 µl enzym EcoRI 1 µl enzym EcoRI 1 µl enzym PstI
1 µl enzym HindIII 1 µl enzym PstI 1 µl enzym HindIII
H2O dejonizowana, jałowa do H2O dejonizowana, jałowa do H2O dejonizowana, jałowa do
koÅ„cowej 20 µl koÅ„cowej 20 µl koÅ„cowej 20 µl
Przygotowane mieszaniny reakcyjne wymieszać, krótko zwirować i inkubować w temp. 37ºC.
W międzyczasie przygotować 1% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym
grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do elektroforezy i
zalać 1x stężonym buforem TBE. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny reakcyjne krótko zwi-
rować, do każdej dodać 2 µl buforu próbkowego i caÅ‚ość nanieść do studzienek w żelu.
UWAGA!!! do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA (trawione enzy-
mami EcoRI i HindIII DNA bakteriofaga  lub marker typu drabinka). Prowadzić rozdział
elektroforetyczny do momentu osiągnięcia przez barwnik 3/4 długości żelu. Po tym czasie żel
wybarwić w roztworze bromku etydyny, obejrzeć w świetle UV i poddać obraz analizie w
celu ustalenia wielkości fragmentów restrykcyjnych.
Wielkości fragmentów w ścieżkach podawane są od najmniejszych:
1 2 3 4 5 6 7
1. Marker wielkoÅ›ci lð EcoRI/HindIII
2. Trawienie EcoRI  5200 pz
3. Trawienie HindIII  5200 pz
4. Trawienie PstI  812 pz, 1080 pz, 3330 pz
5. Trawienie Eco-Hind: 2600, 2600 (Uwaga: dwa fragmenty niemal jednakowej wielkości, stąd na żelu
widoczny jeden intensywnie świecący prążek)
6. Trawienie Eco-Pst:  812 pz, 1080 pz, 3330 pz
7. Trawienie Pst-Hind -  630 pz, 812 pz, 1080 pz, 2700 pz
Ćwiczenie 5
Konstrukcja map restrykcyjnych - zadania
1. Kolisty plazmid trawiono restryktazami. Następujące fragmenty zostały zidentyfikowane w
żelu agarozowym po cięciu poszczególnymi enzymami:
a. EcoRI: 7.0 kpz
b. SalI: 7.0 kpz
c. HindIII: 4.0, 2.0, 1.0 kpz
d. SalI + HindIII: 2.5, 2.0, 1.5, 1.0 kpz
e. EcoRI + HindIII: 4.0, 2.0, 0.6, 0.4 kpz
f. EcoRI + SalI: 2.9, 4.1 kpz
Narysuj mapÄ™ restrykcyjnÄ… plazmidu.
2. Wektor plazmidowy pBS281 został pocięty enzymem BamHI (G^GATCC), który rozpo-
znaje tylko jedno miejsce w tej cząsteczce. Genomowe DNA człowieka zostało natomiast
pocięte enzymem MboI (^GATC), dla którego w DNA człowieka występuje wiele miejsc
restrykcyjnych. Pocięte cząsteczki zostały ze sobą zligowane. Rozpatrujemy tylko te czą-
steczki, które powstały z ligacji plazmidu i fragmentu genomowego DNA. Odpowiedz na
poniższe pytania:
a. Jaka część cząsteczek może zostać przecięta enzymem MboI?
b. Jaka część powstałych cząsteczek może zostać przecięta enzymem BamHI?
c. Jaka część cząsteczek może zostać przecięta enzymem XorII (C^GATCG)?
3. Dane są różne enzymy restrykcyjne wraz z rozpoznawaną sekwencją i zaznaczonym miej-
scem cięcia. Określ jaki rodzaj końców jest uzyskiwany przy cięciu danym enzymem (lepkie,
tępe) a w przypadku końców lepkich, z jakiego rodzaju nadmiernością mamy do czynienia?
a. BamHI (G^GATCC)
b. KpnI (GGTAC^C)
c. SmaI (CCC^GGG)
4. Około 60% par zasad w ludzkim DNA stanowi AT. Jeśli ludzki genom ma 3 miliardy par
zasad, ile razy w genomie wystąpią w przybliżeniu miejsca restrykcyjne dla poniższych en-
zymów?
BamHI (miejsce restrykcyjne 5 -GGATCC-3 )
EcoRI (miejsce restrykcyjne 5 -GAATTC-3 )
HaeIII (miejsce restrykcyjne 5 -GGCC-3 )
TaqI (miejsce restrykcyjne 5 -TCGA-3 )
HindIII (miejsce restrykcyjne 5 -AAGCTT-3 )
PstI (miejsce restrykcyjne 5 -CTGCAG-3 )
SmaI (miejsce restrykcyjne 5 -CCCGGG-3 )
XbaI (miejsce restrykcyjne 5 -TCTAGA-3 )
AscI (miejsce restrykcyjne 5 -GGCGCGCC-3 )
5. Fragment ludzkiego DNA z miejscem EcoRI na jednym końcu i HindIII na drugim końcu
został wyznakowany 32P na końcu EcoRI. Cząsteczka ta została częściowo strawiona innymi
enzymami restrykcyjnymi: HhaI lub Sau3A i rozdzielona elektroforetycznie. Autoradiogram
tego żelu:
HhaI: 1.83; 1.41; 1.32; 0.39; 0.13 kb
Sau3A: 1.83; 1.57; 0.93; 0.58; 0.48; 0.24 kb
Nakreśl mapę restrykcyjną tego fragmentu.
6. Jak wiele fragmentów restrykcyjnych uzyskamy tnąc genomowe DNA człowieka poszcze-
gólnymi enzymami?:
Sau3A (^GATC)
BamHI (G^GATCC)
SfiI (GGCCNNNN^NGGCC)
Przyjmujemy, że wielkość genomu człowieka to 3x109 pz, a poszczególne pary zasad wystę-
pują z częstością 50%.
7. Mamy liniowy fragment DNA długości 14.7 kpz.. Zawiera on miejsca restrykcyjne dla en-
zymów BamHI, EcoRI, HindIII.
B E H B E
-----I----I----------I--------I----I------------
2 1,4 3,5 3 0,8 4
Lewy koniec fragmentu został wyznakowany 32P.
Jakie prążki wyznakowane radioaktywnie zaobserwujemy przy całkowitym cięciu poszcze-
gólnymi enzymami?
Jakie prążki wyznakowane radioaktywnie zaobserwujemy przy niecałkowitym trawieniu po-
szczególnymi enzymami?